PPARγ atenúa la senescencia celular de los macrófagos alveolares en la superposición entre asma y EPOC

Resumen

Antecedentes

La superposición (ACO) entre el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) representa una afección compleja caracterizada por características clínicas y fisiopatológicas compartidas del asma y la EPOC en personas mayores. Sin embargo, la fisiopatología de la ACO sigue sin explorarse. Nuestro objetivo era identificar las principales células inflamatorias en ACO, examinar la senescencia dentro de estas células y dilucidar los genes responsables de regular la senescencia.

Métodos

Se realizaron análisis bioinformáticos para investigar los principales tipos de células y las firmas de senescencia celular en un conjunto de datos público de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-Seq) derivado de los tejidos pulmonares de pacientes con ACO. Se llevaron a cabo análisis similares en un estudio de cohorte independiente Mecanismos inmunes para el asma grave (IMSA), que incluyó datos masivos de RNA-Seq y CyTOF de muestras de líquido de lavado broncoalveolar (BALF).

Resultados

El análisis de los datos de scRNA-Seq reveló que los monocitos/macrófagos eran el tipo de célula predominante en los tejidos pulmonares de los pacientes con ACO, constituyendo más del 50% de las células analizadas. Los monocitos/macrófagos pulmonares de pacientes con ACO exhibieron una menor prevalencia de senescencia definida por puntuaciones de enriquecimiento más bajas de SenMayo y niveles de expresión de marcadores de senescencia celular. Curiosamente, el análisis del conjunto de datos de IMSA mostró resultados similares en pacientes con asma grave. También mostraron una menor prevalencia de senescencia, particularmente en los macrófagos CD206 + de las vías respiratorias, junto con una mayor expresión de citocinas (p. ej., IL-4, IL-13y IL-22). Una exploración adicional identificó los macrófagos alveolares como un subtipo importante de monocitos/macrófagos que impulsan la senescencia celular en la ACO. Los genes expresados ​​diferencialmente relacionados con la oxidación-reducción, las citoquinas y los factores de crecimiento estuvieron implicados en la regulación de la senescencia en los macrófagos alveolares. PPARγ (receptor gamma activado por proliferador de peroxisomas) surgió como uno de los reguladores predominantes que modulan la firma senescente de los macrófagos alveolares en ACO.

Conclusión

Los hallazgos sugieren que la senescencia en los macrófagos, particularmente en los macrófagos alveolares, juega un papel crucial en la fisiopatología de la ACO. Además, PPARγ puede representar un objetivo terapéutico potencial para intervenciones destinadas a modular los procesos asociados a la senescencia en ACO. Palabras clave ACO, asma, EPOC, macrófagos, senescencia, PPARγ.

Introducción

El asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) son dos de las enfermedades pulmonares obstructivas más prevalentes. La superposición entre asma y EPOC (ACO, por sus siglas en inglés) es un término utilizado para describir una afección compleja caracterizada por características clínicas y fisiopatológicas compartidas de ambas enfermedades, que generalmente se observa en personas mayores con una larga historia de enfermedad y exposición a factores ambientales.1,2,3). Se estima que la ACO afecta aproximadamente al 10-30% de las personas con asma y alrededor del 25% de las personas con EPOC (4). Se cree que las exposiciones ambientales acumulativas, como la exposición a alérgenos y partículas o gases tóxicos (p. ej., fumar y biomasa interior), desempeñan un papel crucial en el desarrollo y progresión de la ACO (1, 5). Además, el asma y la atopia han sido identificados como potenciales factores de riesgo para el desarrollo de EPOC y, en consecuencia, ACO (6). Más importante aún, los pacientes con ACO a menudo experimentan mayores tasas de exacerbaciones y síntomas clínicos, lo que plantea un desafío importante para el tratamiento y manejo clínico.7, 8). Sin embargo, el tratamiento de los pacientes con ACO puede resultar complicado debido a la naturaleza superpuesta de estas enfermedades.

Los mecanismos inflamatorios en el asma y la EPOC son distintos. En el asma, la inflamación es impulsada principalmente por respuestas mediadas por células Th2, lo que conduce a una inflamación eosinofílica y un aumento de citocinas como IL-4, IL-5 e IL-13.9. Por otro lado, la EPOC se caracteriza por una inflamación con una mayor presencia de neutrófilos y un predominio de respuestas mediadas por células Th1 y Th17.9). En ambas condiciones, los macrófagos, las principales células inmunitarias de los pulmones, desempeñan funciones cruciales en la respuesta inmunitaria, la defensa contra infecciones, la homeostasis tisular y la resolución de la inflamación.10). Los macrófagos en el asma y la EPOC pueden contribuir a la inflamación y remodelación de las vías respiratorias mediante la liberación de citoquinas proinflamatorias, proteasas y especies reactivas de oxígeno.11, 12). Por tanto, es razonable creer que los macrófagos también desempeñan un papel vital en los procesos inflamatorios y la fisiopatología de la ACO.

La ACO se diagnostica con mayor frecuencia en personas mayores y su prevalencia tiende a aumentar con la edad, como lo respaldan varios estudios (13, 14). La edad ha sido identificada como un factor de riesgo significativo para ACO en pacientes con asma (15). En consecuencia, el proceso de envejecimiento y la senescencia parecen desempeñar un papel importante en el desarrollo de la inflamación pulmonar en individuos con ACO. La senescencia representa un estado celular complejo caracterizado por estrés celular, daño al ADN, detención del ciclo celular y la liberación de factores del fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP).dieciséis,17,18). Estos factores SASP abarcan quimiocinas, citocinas, factores de crecimiento, moléculas de adhesión y componentes lipídicos que pueden contribuir a múltiples trastornos relacionados con la edad con consecuencias tanto locales como sistémicas.19,20,21,22,23,24,25,26). Vale la pena señalar que la senescencia celular se ha asociado tanto con el asma (27, 28) y EPOC (29,30,31). En consecuencia, la senescencia puede ejercer una influencia significativa en el desarrollo y manejo de la ACO. Sin embargo, es esencial reconocer que la senescencia es un proceso complejo influenciado por factores como el tipo de célula, la edad y enfermedades específicas (28, 32). Por lo tanto, es crucial investigar si la senescencia en los macrófagos pulmonares contribuye a los procesos inflamatorios y la fisiopatología exclusiva de la ACO.

En nuestra investigación actual, realizamos un análisis utilizando datos de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-Seq) disponibles públicamente obtenidos de tejidos pulmonares humanos, comparando individuos con y sin ACO. Nuestro enfoque principal fue identificar los principales tipos de células e identificar monocitos/macrófagos como los tipos de células predominantes en pacientes con ACO. Profundizamos en las firmas genéticas asociadas con la senescencia, específicamente dentro de los monocitos/macrófagos. Los hallazgos se validaron aún más mediante otra cohorte independiente (IMSA) con un énfasis específico en la investigación de la relación entre las características de la senescencia celular y la gravedad del asma. Además, exploramos genes y vías expresados ​​diferencialmente dentro de los macrófagos alveolares de individuos con ACO e identificamos PPARγ como un factor regulador clave en el impulso de la senescencia celular en los macrófagos alveolares.

Métodos

Fuente de datos

Los datos de scRNA-Seq estaban disponibles públicamente y se generaron a partir de tejidos pulmonares humanos de un paciente con ACO que murió con exacerbación y dos donantes de trasplante (33). Los datos de Bulk RNA-Seq y citometría de masas (citometría por tiempo de vuelo, CyTOF) se derivaron de muestras de líquido de lavado broncoalveolar (BALF) y se descargaron de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) con el número de acceso GSE136587 y el Flow Repository ( FR) base de datos con el identificador FR-FCM-Z39535. Los datos se recopilaron como parte del estudio Immune Mechanisms Severe Asthma (IMSA) e implicaron el análisis de células alveolares y de las vías respiratorias distales obtenidas mediante broncoscopía. El estudio incluyó un total de 39 sujetos: 6 controles sanos, 17 pacientes con asma leve/moderada y 16 pacientes con asma grave.

Procesamiento y análisis de secuencias de ARN unicelulares.

Control de calidad

Las matrices de recuentos sin procesar descargadas se cargaron en el espacio de trabajo de R para iniciar un flujo de trabajo de Seurat. Se realizaron una serie de pasos de preprocesamiento críticos para garantizar la calidad de los datos antes del análisis. Específicamente, se eliminaron las células con un recuento de identificadores moleculares únicos (UMI) inferior a 500, las células que expresaban menos de 200 genes con un valor log10GenesPerUMI inferior a 0,75 y las células con expresión de genes mitocondriales que contribuían a más del 20 % de la expresión génica total.

Reducción de dimensiones y anotación de celda.

Siguiendo los procedimientos de control de calidad, los datos procesados ​​se integraron utilizando distintas estrategias: el conjunto de datos completo se integró utilizando Seurat (34), mientras que el subconjunto de monocitos/macrófagos se integró utilizando el enfoque de armonía (35). La reducción de dimensionalidad y la visualización se lograron utilizando el algoritmo de proyección y aproximación de colector uniforme (UMAP). UMAP no sólo captura distancias intercelulares sino que también proporciona una visión holística de la estructura global de los datos (36). Los grupos de células se identificaron mediante el algoritmo de Leiden, un algoritmo automatizado diseñado para agrupar células de manera efectiva en datos de scRNA-seq (37). Los marcadores celulares fueron aquellos con genes expresados ​​diferencialmente (DEG) identificados mediante la función FindAllMarkers del paquete Seurat. Las anotaciones celulares se identificaron mediante SingleR o manualmente según la expresión de un marcador específico, lo que nos permite obtener la composición y la dinámica de las celdas dentro del conjunto de datos (38).

Análisis de expresión diferencial.

Los análisis de expresión diferencial se realizaron utilizando el paquete Libra R (Versión 1.0.0). En este marco, se empleó la función “run_de”, aplicando pruebas de suma de rangos de Wilcoxon para evaluar diferencias estadísticas entre grupos. Los genes con un valor de P ajustado <0,05 y un cambio log2 absoluto (|log2FC|)> 0,5 se denominaron significación estadística. Además, las funciones “FindMarkers” y “FindAllMarkers” del paquete Seurat también se utilizaron para identificar marcadores que distinguen grupos de células con pruebas de suma de rangos de Wilcoxon.

Análisis de enriquecimiento

Los análisis de enriquecimiento incluyeron puntuación de conjuntos genéticos a través del algoritmo AUCell y análisis de sobrerrepresentación (ORA). Se empleó el algoritmo AUCell para medir el enriquecimiento de la senescencia celular. Este algoritmo calculó una puntuación de enriquecimiento yuxtaponiendo los datos de entrada con el conjunto de genes de senescencia SenMayo, una opción óptima para la detección de senescencia ya que consistentemente…

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