Resumen
Antecedentes
El síndrome de apnea-hipopnea obstructiva del sueño (SAHOS) es un trastorno respiratorio prevalente caracterizado por hipoxia intermitente (HI), que promueve complicaciones pulmonares. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la remodelación pulmonar inducida por HI siguen siendo poco conocidos.
Métodos
Realizamos un análisis completo de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) del tejido pulmonar de ratones expuestos a IH (GSE145435). Se utilizaron enfoques computacionales para caracterizar la heterogeneidad celular, los programas transcripcionales y las interacciones entre células. Los hallazgos clave se validaron mediante estudios de intervención con el inhibidor de SP1 plicamicina.
Resultados
Nuestro análisis reveló lo siguiente: IH indujo: (1) la expansión de cuatro subconjuntos distintos de fibroblastos; (2) polarización de Mφ1 proinflamatorio (IL-18 alto) con señalización de PPAR activada; (3) dinámica de células T alterada que presenta acumulación de células T CD4⁺ y células T de memoria reducidas; (4) remodelación endotelial (dominancia del subtipo endo2) mediada por interacciones Ccl6-Ccr2. Además, la inhibición de SP1 atenuó la patología inducida por HI, reduciendo la deposición de colágeno y los marcadores inflamatorios.
Conclusiones
Este estudio identifica a SP1 como un regulador maestro de la remodelación pulmonar inducida por HI mediante el control coordinado de las vías fibróticas, inflamatorias y vasculares. Estos hallazgos proporcionan información mecanística sobre las complicaciones relacionadas con el SAHOS y destacan la inhibición de SP1 como una posible estrategia terapéutica para la lesión pulmonar inducida por hipoxia.
Resumen gráfico
Introducción
El síndrome de apnea-hipopnea obstructiva del sueño (SAHOS) es un trastorno respiratorio común relacionado con el sueño caracterizado por hipoxia intermitente (HI) y fragmentación del sueño causada por estenosis o colapso de las vías respiratorias durante el sueño.1). Según las estadísticas epidemiológicas, aproximadamente 936 millones de personas entre 30 y 69 años padecen OSAHS en todo el mundo. China tiene el mayor número de pacientes con SAHOS, con más de 176 millones de personas, incluidos 65,52 millones con SAHOS de moderado a grave (2). Según una encuesta, la incidencia de OSAHS aumenta con la edad y el número de episodios de apnea que ocurren durante la noche en personas mayores sanas suele ser mayor que en personas de mediana edad, alcanzando su punto máximo aproximadamente después de los 65 años; Estos eventos son más comunes en hombres (3). En las últimas décadas, la comprensión de la fisiopatología relacionada con el OSAHS ha progresado relativamente lentamente debido a las limitaciones en la obtención de muestras de enfermedades y el desarrollo de modelos de enfermedades. Sin embargo, muchos estudios han confirmado los efectos negativos del SAHS en diversos órganos y sistemas del cuerpo. Numerosos estudios observacionales han demostrado que el SAHS está asociado con enfermedades cardiovasculares y es un factor de riesgo de hipertensión, mal control de la presión arterial, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca, arritmia, muerte cardíaca súbita y mortalidad por todas las causas (4, 5). En el hígado, se ha demostrado que el HI causa resistencia a la insulina, disfunción de pasos clave en el metabolismo de los lípidos, aterosclerosis, disfunción mitocondrial, inflamación y esteatosis y fibrosis hepática.6, 7). También se han observado cambios sustanciales en la microbiota intestinal tanto en modelos animales de HI como en muestras de humanos con SAHOS.8, 9). Además, estudios recientes han explorado asociaciones entre HI y neurotoxicidad, progresión del cáncer, disfunción renal y anomalías reproductivas (10,11,12).
El órgano más directamente afectado por la HI son los pulmones. A pesar de los avances en la comprensión de la patología del HI en diversos tipos de enfermedad y disfunción pulmonar, las características celulares de los pulmones expuestos al HI siguen siendo en gran medida desconocidas y oscuras. Si bien se han centrado más investigaciones en los cambios en la función de las células individuales, la compleja red de interacciones célula-célula en el microambiente se ha descuidado en gran medida debido a la dificultad de estudiarla.13).
El objetivo de este estudio fue establecer un panorama unicelular de alta resolución de diferentes tipos de células mediante el análisis de datos de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) del tejido pulmonar de ratón expuesto a IH para comprender completamente la respuesta de las principales células del pulmón a IH. Las características celulares y moleculares identificadas en este estudio no solo mejoran nuestra comprensión de los mecanismos que impulsan la patología pulmonar crónica en pacientes con OSAHS, sino que también proporcionan evidencia preliminar que respalda el potencial terapéutico de apuntar a factores regulatorios clave, informando así futuras estrategias de tratamiento para OSAHS.
Materiales y métodos
Adquisición, reducción de dimensionalidad y anotación celular de datos scRNA-seq.
Se recuperaron seis conjuntos de datos scRNA-seq de tejido pulmonar de ratón del Gene Expression Omnibus (GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) base de datos, específicamente con el número de acceso GSE145435 (detalles en la Tabla complementaria 1) (14). Estos conjuntos de datos se generaron en la plataforma Illumina HiSeq 2500, logrando una profundidad de secuenciación de cobertura de 10 X. El procesamiento de datos inicial se realizó utilizando el paquete Seurat para garantizar la selección de células de alta calidad. Se aplicaron rigurosamente los siguientes criterios de control de calidad: (1) cada gen debe detectarse en un mínimo de tres células; (2) una célula debe exhibir al menos 50 genes detectados; (3) el contenido de genes mitocondriales no debe exceder el 10% del total de genes detectados; y (4) el número de transcripciones por célula debe oscilar entre 200 y 4000. La normalización de los datos se realizó utilizando el método de normalización logarítmica, seguido de la identificación de 1500 genes altamente variables utilizando el parámetro ‘vst’ predeterminado, preparando el escenario para la posterior clasificación del tipo de célula (15). Se empleó el análisis de componentes principales (PCA) para la reducción de dimensionalidad lineal inicial, con los primeros 15 componentes principales (PC) seleccionados para análisis posteriores (16). Los efectos por lotes se mitigaron utilizando el algoritmo Harmony, y el algoritmo de incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (t-SNE) facilitó la agrupación mediante la reducción de dimensionalidad no lineal (17). Los genes marcadores para cada grupo se identificaron utilizando la función FindAllMarkers, con un umbral de valor de P ajustado de <0,05 y un cambio log2 veces absoluto (FC) mayor que 1 que sirve como criterio de selección. Los tipos de células se anotaron manualmente para cada grupo en función de la expresión de estos genes marcadores. Finalmente, el algoritmo Monocle se utilizó para construir trayectorias pseudotemporales, proporcionando información sobre los procesos dinámicos de diferenciación celular o patrones de expresión génica (18).
Modelos animales y métodos terapéuticos.
Teniendo en cuenta que el SAHOS afecta predominantemente a pacientes masculinos, en este estudio utilizamos ratones macho C57BL/6J. Se obtuvieron ratones macho C57BL/6J de 6 a 8 semanas de Wuhan SHULAIBAO Biotechnology Co., Ltd. Todos los animales se alojaron en condiciones específicas libres de patógenos con temperatura y humedad controladas, un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y libre acceso a comida esterilizada y agua potable. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Hospital Tongji, Facultad de Medicina de Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong. La exposición al HI se llevó a cabo utilizando una cámara de hipoxia programable. Los ratones de los grupos IH fueron expuestos a IH durante 8 h diarias (de 8:00 am a 4:00 pm) durante 42 días consecutivos. Cada ciclo de 4 minutos consistió en 150 s de hipoxia (5% O2) seguidos de 90 s de normoxia (21% O2), repetidos continuamente durante el período de exposición de 8 horas (19, 20). Los ratones de control se mantuvieron en condiciones de aire ambiente normóxico durante el mismo período. Todos los ratones fueron sacrificados y los tejidos pulmonares se recolectaron 12 h después de la exposición final a IH el día 42.
Se realizaron dos experimentos independientes. En el primer experimento, 12 ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos (n = 6 por grupo): control e IH. En el segundo experimento, 24 ratones fueron asignados aleatoriamente a cuatro grupos (n = 6 por grupo): control, IH, plicamicina e IH + plicamicina. Se disolvió plicamicina (HY-A0122, MCE), un inhibidor de SP1, en una solución vehículo que constaba de 10 % de DMSO, 40 % de PEG300, 5 % de Tween-80 y 45 % de solución salina, y se administró por vía intraperitoneal a una dosis de 0,4 mg/kg en un volumen final de 100 µl. La administración del fármaco comenzó el día 2 de exposición al HI y se administró en días alternos hasta un total de 21 inyecciones. Cada dosis se administró aproximadamente 30 minutos antes del inicio de la sesión diaria de HI. En el grupo IH + plicamicina, los ratones se sacrificaron 12 h después de la exposición final a IH y la inyección del fármaco.
Análisis histopatológico
Después de anestesiar a los ratones, los tejidos pulmonares se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4% a 4 ℃ durante 24 h. Después de la deshidratación, la parte inferior del pulmón izquierdo se incluyó en parafina y se cortó en secciones de 4 μm de espesor. Se realizó tinción con hematoxilina y eosina (H&E) para el análisis patológico. Dos observadores ciegos calificaron semicuantitativamente la inflamación peribronquial según los siguientes criterios: 0, sin células inflamatorias; 1, una pequeña cantidad de células inflamatorias; 2, una sola capa de células inflamatorias; 3, 2 a 4 capas de células inflamatorias; y 4, más de 4 capas de células inflamatorias que rodean los bronquios. Para cada sección, se evaluaron de tres a cinco campos de alta potencia no superpuestos, seleccionados al azar, y se calculó la puntuación media para representar el resultado de cada animal. Para evaluar la proliferación de células caliciformes se realizó la tinción con ácido periódico-Schiff (PAS), que detecta polisacáridos como el glucógeno y las mucosustancias. Las células caliciformes PAS positivas (PAS+) se contaron en tres a cinco campos de alta potencia (HPF, 400 × aumentos) seleccionados al azar y no superpuestos por sección, y se contó el número de células PAS+ por 100 μm de longitud en las vías respiratorias para cada animal. Se realizó la tinción de Masson para evaluar la deposición de colágeno en los pulmones. Para cada sección, se analizaron de tres a cinco campos seleccionados al azar y las áreas positivas para colágeno se cuantificaron utilizando el software ImageJ calculando el porcentaje de área teñida de azul en relación con…
