Resumen
Antecedentes
Las mitocondrias son propensas al daño oxidativo causado por fuentes endógenas y exógenas de radicales libres, incluido el material particulado (PM). Dado el papel de las mitocondrias en los trastornos inflamatorios, como el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, planteamos la hipótesis de que la suplementación con vitamina D puede desempeñar un papel protector en los daños oxidativos mitocondriales inducidos por PM en las células epiteliales bronquiales BEAS-2B humanas.
Métodos
Las células BEAS-2B se trataron previamente con 1,25 (OH) 2D3, una forma activa de vitamina D, durante 1 h antes de la exposición de 24 horas a PM (SRM-1648a). El estrés oxidativo se midió mediante citometría de flujo. Se analizaron las funciones mitocondriales, incluido el potencial de membrana mitocondrial, los niveles de ATP y el número de copias del ADN mitocondrial. Además, se examinó la ultraestructura mitocondrial mediante microscopía electrónica de transmisión. Los cambios en la concentración de calcio intracelular y mitocondrial se evaluaron mediante citometría de flujo basada en la expresión de Fluo-4 AM y Rhod-2 AM, respectivamente. Las citoquinas proinflamatorias, incluidas IL-6 y MCP-1, se cuantificaron mediante ELISA. Se determinaron los niveles de expresión de antioxidantes, incluidos SOD1, SOD2, CAT, GSH y NADPH.
Resultados
Nuestros hallazgos mostraron en primer lugar que la exposición de 24 horas a PM conducía a la sobreproducción de especies reactivas de oxígeno (ROS) derivadas de las mitocondrias. La oxidación mitocondrial inducida por PM resultó en una acumulación de calcio intracelular, particularmente dentro de las mitocondrias, y alteraciones en la morfología y funciones mitocondriales. Estos cambios incluyeron pérdida de la integridad de la membrana mitocondrial, crestas desordenadas, despolarización de la membrana mitocondrial, producción reducida de ATP y aumento del número de copias del ADN mitocondrial. En consecuencia, el daño mitocondrial inducido por PM desencadenó la liberación de ciertas citoquinas inflamatorias, como IL-6 y MCP-1. De manera similar a las acciones del inhibidor de ROS mitocondrial MitoTEMPO, 1,25 (OH) 2D3 confirió efectos protectores sobre las alteraciones del ADNmt, los daños mitocondriales y la dishomeostasis del calcio, disminuyendo así la liberación de ciertas citocinas inflamatorias. Descubrimos que un mayor nivel celular de 1,25(OH)2D3 regulaba positivamente la expresión de antioxidantes enzimáticos (SOD1, SOD2 y CAT) y no enzimáticos (GSH y NADPH) para modular la homeostasis redox celular.
Conclusión
Nuestro estudio proporciona nueva evidencia de que el 1,25(OH)2D3 actúa como antioxidante, mejorando las respuestas antioxidantes de BEAS-2B para regular la homeostasis mitocondrial de ROS y la función mitocondrial, mejorando así la defensa epitelial contra la exposición a la contaminación del aire.
Fondo
La contaminación del aire ambiental tiene un impacto significativo en la salud humana. La exposición a la compleja mezcla de partículas sólidas y líquidas suspendidas en el aire, como las partículas en suspensión (PM), se ha relacionado con varias afecciones de salud humana, incluida la disminución de la función pulmonar, el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), el eczema y trastornos cardiovasculares (15, 21, 22, 43). Un mecanismo importante es la inducción de estrés oxidativo, que puede alterar múltiples procesos celulares, por ejemplo, inflamación, disfunción de orgánulos, muerte celular y deterioro mitocondrial.26, 29). Dado el impacto generalizado de la exposición a PM en la salud humana, es crucial comprender mejor los mecanismos subyacentes.
La vitamina D juega un papel fundamental en la homeostasis del calcio, los antioxidantes y la regulación inmune (8, 23). Estudios anteriores han informado de la asociación de la deficiencia de vitamina D con la función pulmonar perjudicial (42), enfermedades respiratorias crónicas (13) y dermatitis atópica (10), pero los mecanismos subyacentes aún no se comprenden completamente. Hasta donde sabemos, la capacidad de la vitamina D que afecta la respuesta pulmonar a la toxicidad de PM aún no está clara.
Las mitocondrias desempeñan un papel en la producción de energía y la regulación de las especies reactivas de oxígeno (ROS).1, 19, 36). Estudios previos han informado que las mitocondrias son particularmente vulnerables al daño oxidativo cuando los niveles de ROS exceden la regulación de la defensa antioxidante endógena.18, 20). En respuesta, las enzimas antioxidantes de defensa de primera línea, incluidas la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT) y la glutatión peroxidasa (GPX), así como la forma reducida de NADP+ (o NADPH), se vuelven esenciales para mantener el equilibrio redox.18, 38). Se ha demostrado que el canal aniónico dependiente de voltaje 1 (VDAC-1), un componente del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mTPT), es responsable de regular la entrada y salida de calcio y ROS dentro y fuera de las mitocondrias.11, 35). Las mitocondrias sirven como centros centrales para la amortiguación del calcio intracelular y la interacción bidireccional entre el calcio y las ROS (14, 32).
Hoy en día, estudios limitados han examinado el papel de la vitamina D en la respuesta mitocondrial a la exposición a PM en las células epiteliales. Nuestra hipótesis es que la suplementación con vitamina D brinda protección contra el daño del ADN mitocondrial (ADNmt), el mal funcionamiento mitocondrial y la deshomeostasis del calcio a través de la mejora de las vías antioxidantes en el contexto de la exposición a PM.
Métodos
Preparación de PM, vitamina D activada y reactivos químicos.
SRM-1648a, partículas urbanas ambientales, se adquirió del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) de EE. UU. y se utilizó en este estudio. Estas partículas están formadas por partículas finas y ultrafinas con un diámetro aerodinámico que oscila entre 1,35 y 30,1 μm (media 5,85 μm) y están compuestas por diversos hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) y elementos orgánicos e inorgánicos como hierro, calcio y zinc. La suspensión madre se preparó mediante sonicación durante 1 hora en dimetilsulfóxido (DMSO) para lograr una concentración de PM de 100 mg/ml, siguiendo las pautas del NIST. Luego, la suspensión de PM se almacenó a -80 ℃ antes de su uso. Además, los eliminadores de ROS que incluyen N-acetil-L-cisteína (NAC; 1 µM) y MitoTEMPO (50 µM), así como 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3), una forma activa de vitamina D y antimicina A se obtuvieron de Sigma-Aldrich y se aplicaron en experimentos de exposición in vitro posteriores.
Cultivo y tratamiento celular.
En este estudio se aplicó la línea celular BEAS-2B humana, una línea celular epitelial bronquial no tumorigénica derivada del epitelio bronquial humano. Se cultivaron células BEAS-2B en medio Eagle modificado por Dulbecco/mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F-12) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor y un 1% de antibióticos de penicilina/estreptomicina, y se mantuvieron en un ambiente humidificado. Atmósfera de 95% aire/5% CO2 a 37℃. Cuando las células alcanzaron aproximadamente un 80 % de confluencia, se expusieron a diferentes concentraciones de PM suspendidas en medios reducidos en suero (DMEM/F-12 suplementado con 2 % de FBS) para evaluar sus efectos. La suspensión original de PM se sometió a sonicación durante 1 hora para romper la mayoría de los aglomerados antes de su uso. Además, los experimentos de exposición in vitro se realizaron y completaron dentro de 1 h de la preparación para mantener la coherencia en la distribución del tamaño de las partículas. Para los experimentos que investigan el impacto de la vitamina D tras la exposición a PM, las células BEAS-2B se trataron previamente con 1,25 (OH) 2D3 en medios reducidos en suero durante 1 h antes de la exposición a PM. Las células de control se cultivaron en medio que contenía FBS al 2% y DMSO al 0,1%.
Determinación de la producción de ROS intracelular y mitocondrial.
Los niveles de ROS intracelulares en células BEAS-2B se determinaron mediante análisis fluorométrico utilizando diacetato de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína (DCF-DA; Roche), mientras que los niveles de ROS mitocondriales se examinaron utilizando el indicador de superóxido mitocondrial rojo MitoSOX (Thermo Fisher Scientific). Después del tratamiento con PM y/o 1,25(OH)2D3, se retiraron los medios de cultivo y las células se tiñeron con DCF-DA 10 µM en medios sin suero o colorante rojo MitoSOX 5 µM en solución salina equilibrada de Hanks ( HBSS) que contiene Ca2+ y Mg2+ durante 20 min a 37 ℃ en la oscuridad. Después de la tinción, las células se recogieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría y la intensidad de la fluorescencia se analizó utilizando una citometría de flujo FACSCanto II (BD Biosciences). Se registraron señales fluorescentes para 10.000 células. Los resultados de ROS intracelular se expresaron como un cambio en la intensidad media de fluorescencia (MFI) en relación con los controles, mientras que el porcentaje de células positivas rojas MitoSOX se usó para cuantificar las ROS mitocondriales.
Ensayo de tetrazolio-1 soluble en agua
El ensayo de tetrazolio 1 soluble en agua (WST-1) se utiliza ampliamente para evaluar la actividad metabólica de células viables y la proliferación celular, siguiendo las pautas proporcionadas por el fabricante (Roche).
Evaluación del potencial de membrana mitocondrial.
Utilizamos JC-1, un tinte fluorescente lipófilo, catiónico y de doble emisión de Thermo Fisher Scientific, para detectar células BEAS-2B con deterioro del potencial de membrana mitocondrial (mtMP). En células sanas con mitocondrias polarizadas (mtMP normal), JC-1 forma agregados J fluorescentes de color rojo. Por el contrario, en las células dañadas con mitocondrias despolarizadas (mtMP baja), JC-1 permanece en su forma monomérica, emitiendo fluorescencia verde. Brevemente, se sembraron células BEAS-2B en placas de 6 pocillos y se sometieron a los siguientes tratamientos durante 24 h: PM solo, PM combinado con 1,25(OH)2D3, antimicina A sola o antimicina A combinada con 1,25(OH) )2D3. Después de los tratamientos, las células se tiñeron con colorante JC-1 (JC-1 2 µM en PBS 1x) y se incubaron durante 20 minutos a 37 ℃ en la oscuridad. La intensidad de fluorescencia de los agregados y monómeros de JC-1 se detectó mediante citometría de flujo (FACSCanto II; BD Biosciences) en longitudes de onda de excitación/emisión de 514/590 nm y 514/529 nm, respectivamente. La proporción de fluorescencia roja a verde se usó para determinar mtMP, expresada como porcentaje con respecto a los controles.
Detección del nivel de ATP intracelular
Utilizamos un kit de ensayo colorimétrico (Abcam ab83355) para medir los niveles de ATP celular. Después del tratamiento con PM y/o 1,25 (OH) 2D3, recolectamos 1 × 106 células, las enjuagamos en PBS frío y las homogeneizamos en tampón de ensayo ATP. Después de la centrifugación a 13.000 g durante 5 minutos a 4 ℃, mezclamos 50 µl del sobrenadante con 50 µl de mezcla de reacción de ATP. Una vez que la reacción…
