La transcriptómica unicelular destaca las desregulaciones inmunológicas de los monocitos en la patobiología de la EPOC

Abstracto

Antecedentes

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad respiratoria común, cuya complejidad patogénica estuvo fuertemente asociada con el envejecimiento/tabaquismo y es poco conocida.

Métodos

Aquí realizamos un análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) de 66 610 células de EPOC y tejidos pulmonares de control estratificados por edad de donantes con diferentes antecedentes de tabaquismo para priorizar los tipos de células más perturbados en los pulmones de EPOC de manera independiente o dependiente del envejecimiento/tabaquismo. Al realizar una serie de análisis bioinformáticos avanzados, como análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes, análisis de trayectoria, análisis de interacciones célula-célula, análisis de potencial regulatorio, análisis de red de correlación ponderada, análisis de interacción funcional y análisis de variación de conjuntos de genes, integramos el tipo de célula- alteraciones de nivel en un mal funcionamiento a nivel de sistema y proporcionó un modelo patológico de EPOC más claro que contiene mecanismos específicos por los cuales el envejecimiento y el tabaquismo facilitan el desarrollo de la EPOC. Finalmente, integramos los datos de scRNA-seq disponibles públicamente de 9 individuos, lo que resultó en un total de 110 931 células, y replicamos los análisis para mejorar la credibilidad de nuestros hallazgos.

Resultados

Nuestro estudio apuntó al enriquecimiento de la alteración molecular de la EPOC en los monocitos, lo que indujo aún más un efecto proinflamatorio no reconocido previamente en las células epiteliales alveolares. Además, los monocitos envejecidos y las células del club facilitaron el desarrollo de la EPOC al mantener un nicho autoinmune en las vías respiratorias. Inesperadamente, los macrófagos, cuyo defecto para resolver la inflamación se reconoció durante mucho tiempo en la patogénesis de la EPOC, indujeron principalmente un desequilibrio del reóstato de esfingolípidos de una manera dependiente del tabaquismo. Estos hallazgos se validaron en un metanálisis que incluyó otros datos transcriptómicos unicelulares públicos.

Conclusiones

En resumen, nuestro estudio proporcionó una visión clara de la patogenia de la EPOC y demostró el potencial de dirigirse a los monocitos en el diagnóstico y tratamiento de la EPOC.

Antecedentes

Como causa principal de morbilidad y mortalidad crónicas en todo el mundo, la EPOC resulta de una interacción compleja de predisposición genética y exposiciones ambientales [1]que implica una serie de procesos patológicos, incluido el estrés oxidativo [2]desequilibrio proteasa-antiproteasa [3]células inflamatorias y mediadores [4] así como autoinmunidad reportada recientemente [5]reprogramación metabólica [6]perturbaciones en el microbioma pulmonar [7]y senescencia celular acelerada [8]. Por otro lado, la patogenia de la EPOC suele manifestarse clínicamente en individuos de edad avanzada después de años de fumar cigarrillos, lo que da crédito a la noción de que el envejecimiento y el tabaquismo, junto con sus consecuencias biológicas, son mecanismos importantes en la patogenia de la enfermedad. [9]. A pesar de todas las características del envejecimiento [10] e inflamando [11, 12] observado en pacientes con EPOC, las implicaciones del envejecimiento en la patogénesis de la EPOC no se han entendido completamente. Lo mismo ocurre con el tabaquismo. Los tejidos pulmonares expuestos al humo del cigarrillo se manifiestan de manera complicada en términos de tipos de enfermedades, sitios de patogenia y composición celular. [13]. Nuevos conocimientos, como la dishomeostasis del hierro [14]remodelación lipidómica [15]y cambios en el metabolismo del hemo [16] enriqueció nuestra comprensión mecanicista del tabaquismo en el desarrollo de la EPOC y al mismo tiempo complicó el problema. Por lo tanto, una clave para el enigma de la complejidad patológica es desentrañar la heterogeneidad de la EPOC mientras se distinguen los roles de estos dos factores de riesgo bien reconocidos para facilitar la EPOC. Desafortunadamente, pocos estudios han abordado realmente este desafío, ni han aclarado completamente las características patológicas centrales y los mecanismos de la EPOC.

Estudios recientes han adoptado la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) para explorar los mecanismos específicos de tipo celular de la EPOC [17,18,19,20,21]. Aquí, al aprovechar esta tecnología de resolución unicelular junto con una estrategia analítica bien diseñada, buscamos evaluar la alteración asociada a la EPOC independientemente del tabaquismo y el envejecimiento (definida como patología “central de la EPOC”) y aclarar los mecanismos facilitadores del envejecimiento. y fumar Con este fin, analizamos los datos transcriptómicos unicelulares de más de 65.000 células en tejidos pulmonares de pacientes con EPOC y de donantes ancianos y jóvenes sanos, con diferentes antecedentes de tabaquismo. Para mejorar la credibilidad de nuestros hallazgos, replicamos los análisis al incluir los datos de scRNA-seq de 9 personas de una publicación reciente. [22], dando como resultado un total de 110.931 celdas. Colectivamente, nuestro estudio priorizó los tipos de células en condiciones de EPOC, envejecimiento y tabaquismo de forma independiente; disfunciones a nivel de sistema representadas en cada condición en función de alteraciones a nivel de tipo de célula; y estableció además un modelo patológico aclarado del “núcleo de la EPOC” que contiene mecanismos específicos que median las contribuciones del envejecimiento y el tabaquismo al desarrollo de la EPOC. Al clasificar la heterogeneidad tanto de la enfermedad como de los principales factores de riesgo, brindamos información más simple y clara sobre la patogenia de la EPOC relacionada con el envejecimiento y el tabaquismo, lo que subraya el potencial de los monocitos previamente desapercibidos como advertencia temprana y objetivo terapéutico para la EPOC.

Métodos

Muestras de tejido pulmonar humano y declaración ética

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Nanjing (IRB-GL1-AF08). Cumplimos con todas las normas éticas pertinentes y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada paciente antes de la cirugía. Solo se incluyeron pacientes con tumores pulmonares primarios no metastásicos no tratados a los que se les realizó resección del lóbulo pulmonar con intención curativa y se dividieron en tres grupos según función pulmonar y edad: grupo EPOC (según las guías GOLD) (2 fumadores activos y 1 grupo de no fumadores, 62 ± 11,53), grupo de ancianos normales (≥ 65 años) (2 fumadores activos y 1 no fumador, 73 ± 2,00), y grupo de jóvenes normales (≤ 40 años) (3 no fumadores, 30 ± 4,36 ). Ningún paciente tenía antecedentes de asma o disfunción renal. Los datos clínicos e histológicos de los pacientes se muestran en Datos complementarios1 y Archivo adicional 2: Figura S1A. Durante la cirugía, todas las muestras se obtuvieron de lóbulos resecados a más de 5 cm del borde del tumor para eliminar la influencia del cáncer.

Análisis de datos de secuenciación de ARN unicelular

Se utilizó el canal de análisis BD Rhapsody para procesar los datos de secuenciación y el genoma de referencia fue GENCODE v29. La matriz de expresión se procesó con Seurat (versión 3.1.5). Se eliminaron las células que tenían menos de 301 genes expresados ​​o más del 30 % de identificadores moleculares únicos (UMI) que se originaban en las mitocondrias. Los recuentos de UMI se normalizaron y se transformaron a logaritmo transformado. Se realizó la integración de nueve conjuntos de datos para corregir el efecto por lotes. La visualización de los perfiles transcriptómicos se realizó mediante proyección y aproximación de variedad uniforme (UMAP). El algoritmo de optimización de modularidad de Louvain se aplicó para agrupar células de forma iterativa en grupos. Los grupos de células se anotaron en tipos de células biológicas conocidas utilizando genes marcadores de células canónicas. El análisis de expresión diferencial se realizó utilizando MAST (1.14.0). Los tipos de células más relevantes para una condición específica se clasificaron por el número de DEG después de tener en cuenta el tamaño de las células. El análisis de priorización de tipos de células en tres condiciones (EPOC, envejecimiento y tabaquismo) se realizó utilizando el paquete Augur R (versión 1.0.0). El análisis de enriquecimiento de Gene Ontology y el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) se realizaron utilizando el clusterProfiler (versión 3.14.3). El análisis de variación del conjunto de genes (GSVA) ​​se realizó utilizando el paquete GSVA R (versión 1.34.0). El enriquecimiento de DEG entre los genes de riesgo de EPOC GWAS se realizó mediante la prueba exacta de Fisher, con todos los genes detectados> 10% de las células en cada grupo utilizado como fondo. La red de coexpresión de células alveolares tipo 2 se realizó mediante el análisis de red de coexpresión génica ponderada (WGCNA) (versión 1.69)….

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