La transcriptómica comparativa en la EPOC humana revela genes desregulados expresados ​​únicamente en hurones

Resumen

Fondo

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad pulmonar progresiva con pocas opciones de tratamiento. Sin embargo, la mayoría de los modelos de ratón de la EPOC producen una enfermedad principalmente enfisematosa que no recapitula las características clínicamente significativas de la EPOC, como la bronquitis crónica.

Métodos

hurones de tipo salvaje (Mustela putorius furo) se dividieron aleatoriamente en dos grupos: exposición al humo del cigarrillo en todo el cuerpo y controles de aire. Los hurones fueron expuestos al humo de los cigarrillos de investigación 1R6F dos veces al día durante seis meses. La secuenciación de ARN se realizó en ARN aislado de tejido pulmonar. Se realizaron análisis transcriptómicos comparativos de EPOC en hurones, ratones y humanos para encontrar los genes expresados ​​de manera única. Además, se realizó una PCR en tiempo real para confirmar los datos de RNA-Seq en múltiples genes seleccionados.

Resultados

El análisis de la secuencia de ARN identificó 420 genes expresados ​​diferencialmente (DEG) que estaban asociados con el desarrollo de la EPOC en los hurones. Mediante análisis comparativo, identificamos 25 DEG que se expresan de forma única en hurones y humanos, pero no en ratones. Entre los DEG, varios se relacionaron con la depuración mucociliar (NEK-6, HAS1 y KL), mientras que otros se correlacionaron con función pulmonar anormal (IL-18), inflamación (TREM1, CTSB) o estrés oxidativo (SRX1, AHRR ). Múltiples vías celulares se alteraron de manera aberrante en el modelo de hurón con EPOC, incluidas las vías asociadas con la patogénesis de la EPOC en humanos. La validación de estos DEG únicos seleccionados mediante PCR en tiempo real demostró > cambios absolutos de 2 veces en el ARNm frente a los controles de aire, de acuerdo con el análisis de ARN-seq.

Conclusión

La EPOC inducida por el humo del cigarrillo en hurones modula la expresión génica en consonancia con la EPOC humana y sugiere que el modelo de hurón puede ser especialmente adecuado para el estudio de aspectos de la enfermedad.

Fondo

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad heterogénea diagnosticada típicamente por obstrucción irreversible del flujo de aire y síntomas respiratorios persistentes. [1, 2]. La EPOC sigue estando entre las cinco principales causas de muerte en todo el mundo [3] y todavía carece de tratamientos farmacológicos que puedan mitigar la progresión de la EPOC y los síntomas persistentes del fenotipo de bronquitis crónica que incluyen tos crónica y producción de esputo. Los estudios genéticos pueden revelar nuevos mecanismos y sugerir posibles estrategias terapéuticas para la investigación.

El tabaquismo y la exposición crónica a otros contaminantes inhalados son los principales factores de riesgo ambientales que impulsan la patogenia de la EPOC que ejercen una desregulación de la expresión génica en el pulmón y en los tejidos extrapulmonares [4,5,6]. Sin embargo, los hallazgos transcriptómicos en estudios humanos no pueden controlar las variaciones fenotípicas que se pueden lograr usando sistemas experimentales, y los estudios en animales se han limitado en gran medida a estudios en ratones. [5, 6]. Los ratones están entre los modelos más utilizados para estudiar la EPOC [7, 8]sin embargo, producen principalmente una enfermedad enfisematosa muy leve y no desarrollan características patognomónicas de bronquitis crónica o hipersecreción de moco. [9]. Para remediar esto, desarrollamos un modelo de exposición al humo del cigarrillo en hurones que recapitula las características del enfisema, así como la bronquitis crónica asociada a la EPOC, incluida la remodelación de las vías respiratorias, la metaplasia mucosa, la enfermedad pulmonar mucoobstructiva y las exacerbaciones infecciosas periódicas. [10,11,12,13].

En el informe actual, realizamos perfiles de transcriptomas de hurones con EPOC y comparamos los hallazgos con resultados anteriores de pulmones con EPOC humanos. [14] y un modelo de ratón de la EPOC [6]. En general, buscamos identificar si nuestro modelo de hurón de EPOC captura firmas genéticas únicas en comparación con los modelos de ratón que pueden ayudar a mejorar la comprensión de la patogénesis molecular de la EPOC humana y promover el desarrollo de terapias nuevas y efectivas.

materiales y métodos

Exposición al humo del cigarrillo en hurones

Hurones emparejados por edad y sexo (Mustela putorious furo) se obtuvieron de Marshall BioResources y se expusieron al aire ambiente o al humo de cigarrillo generado por un generador de humo de cigarrillo automatizado (TSE Systems, Chesterfield, MO). La exposición al humo consistió en 1 h de humo de cigarrillos de investigación 1R6F, dos veces al día durante al menos 6 meses. Los animales fueron monitoreados continuamente para partículas (200 ug/L) y niveles de CO (~ 1% a ~ 3%). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad de Alabama en Birmingham (IACUC 20232).

aislamiento de ARN

Después de la eutanasia, se extrajo el ARN de muestras de pulmón de hurón recién congeladas usando un Mini Kit RNeasy (Qiagen, Germantown, MD, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La integridad y la concentración del ARN se examinaron antes del procesamiento de RNA-seq.

Secuenciación de próxima generación en plataformas Illumina

La secuenciación del ARNm se realizó en un sistema Illumina NextSeq 500 según lo descrito por el fabricante (Illumina Inc., San Diego, CA, EE. UU.). Brevemente, la calidad del ARN total se evaluó utilizando el bioanalizador Agilent 2100. Se usó ARN con un Número de integridad de ARN (RIN) de 7,0 o superior para la preparación de la biblioteca de secuenciación. Utilizamos el kit de biblioteca Agilent SureSelect Strand Specific mRNA según las instrucciones del fabricante (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.). La construcción de la biblioteca comenzó con dos rondas de selección de poliA utilizando perlas magnéticas que contenían oligo dT. El ARNm resultante se fragmentó aleatoriamente con cationes y calor, seguido de la síntesis de la primera hebra utilizando cebadores aleatorios con inclusión de actinomicina D (concentración final de 2,4 ng/µl). La producción de ADNc de la segunda hebra se realizó con técnicas estándar y los extremos del ADNc resultante se hicieron romos, con cola A y adaptadores ligados para la indexación para permitir la multiplexación durante la secuenciación. Las bibliotecas de ADNc se cuantificaron mediante qPCR en un Roche LightCycler 480 con el kit Kapa Biosystems para la cuantificación de bibliotecas Illumina (Kapa Biosystems, Woburn, MA, EE. UU.) antes de la generación de grupos. La generación de clústeres se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para el agrupamiento integrado (Illumina). Se completaron ciclos de secuenciación de 75 pb de extremos emparejados para permitir una mejor alineación de las secuencias con el genoma de referencia.

Análisis de secuencia de ARN

Los datos de RNA-seq de 12 hurones individuales (seis hurones para condiciones experimentales de aire y humo, respectivamente) se secuenciaron utilizando un sistema Illumina NextSeq 500 (archivo adicional 1: Tabla S1). Se generaron lecturas emparejadas de 75 pb. Las evaluaciones de calidad de prealineación de las secuencias fastq sin procesar se llevaron a cabo utilizando FastQC (versión 0.11.7) (Andrews, 2010). El número de lecturas de extremos emparejados para las doce muestras varía de 35 a 57 M (archivo adicional 2: Tabla S2, archivo adicional 3: Figura S1). Las secuencias fastq sin procesar se alinearon con el Mustela putorius furo genoma de referencia (acceso al ensamblado GenBank: GCA_000215625.1) [15]. Los alineamientos se realizaron mediante STAR (versión 2.7.1a) [16]. (–outFilterType BySJout –outFilterMultimapNmax 20 –alignSJoverhangMin 8 –alignSJDBoverhangMin 1 –outFilterMismatchNmax 999 –outFilterMismatchNoverReadLmax 0.04 –alignIntronMin 20 -alignIntronMax 1000000 –alignMatesGapMax 1000000; según las opciones del parámetro ENCODE STAR para RNA-seq). Las evaluaciones de calidad posteriores a la alineación se llevaron a cabo con RSeQC (versión 2.6.3) [17]. Samtools (versión 0.0.19) [18] e IGV (versión 2.6.2) se utilizaron para indexar y visualizar las alineaciones respectivamente. La expresión génica se cuantificó como recuentos de niveles de genes utilizando la función htseq-count (versión 0.12.3) [19]. Las anotaciones del gen Ensembl para Mustela putorius furo (genebuild-última actualización 2016-05) se utilizó [20]. Se usaron los parámetros predeterminados de htseq-count, excepto el parámetro de hebra, que se configuró en reversa para considerar el grado de varamiento de la biblioteca. DESeq2 filtró los recuentos bajos; Se filtraron los genes para los que hay menos de 3 muestras con recuentos normalizados mayores o iguales a 4. Para cada muestra, los recuentos de lectura se normalizaron utilizando el método de normalización de la relación media. Los efectos por lotes se evaluaron utilizando ComBat…

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