Resumen
Antecedentes
Profilina 2 (PFN2), indispensable en todos los organismos, es importante para el inicio y progresión del cáncer. Aquí, encontramos a PFN2 altamente sobreexpresado en los tejidos tumorales con mal pronóstico de los pacientes con adenocarcinoma de pulmón (LUAD) tenían un papel novedoso en la remodulación de la angiogénesis. Sin embargo, el mecanismo de la angiogénesis de Luad mediada por PFN2 permanece poco selucida.
Métodos
La inmunohistoquímica y la transferencia Western se usaron para detectar los niveles de expresión de proteínas relacionadas en las células de tejido o cáncer de pulmón. Para dilucidar los mecanismos subyacentes, identificamos socios de unión de PFN2 a través de la espectrometría de masas, la coinmunoprecipitación y las técnicas de modelado molecular. Además, investigamos la función de promoción angiogénica de PFN2 utilizando un modelo de angiogénesis basado en gotas tridimensionales capaz de simular el microambiente hipóxico tumoral.
Resultados
Nuestro hallazgo revela que PFN2 se sobreexpresó en tumores en comparación con los tejidos no adyacentes. Su caída afectó notablemente la proliferación, y la angiogénesis de las células Luad a través de la vía de señalización NF-κB/HIF-1α relacionada con la hipoxia, con disminución del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Además, la piruvato quinasa M2 (PKM2), una enzima fundamental en la glucólisis, es un nuevo socio de unión de PFN2. Se observó que la translocación nuclear de PKM2 depende de la expresión de PFN2 y su interacción, lo que modula funcionalmente la angiogénesis en el cáncer de pulmón.
Conclusiones
Nuestro estudio reveló la angiogénesis tumoral de Oncogene PFN2 en LUAD mediante la regulación de la translocación nuclear de PKM2, proporcionando nuevos objetivos de terapia molecular para el tratamiento con LUAD.
Introducción
El adenocarcinoma de pulmón (LUAD), como uno de los tumores malignos relacionados con el cáncer de pulmón más común, tiene una incidencia y mortalidad extremadamente altas principalmente debido a su inevitable agresividad y metástasis (1). Los procesos biológicos significativos durante la metástasis tumoral es la angiogénesis microvascular, que consiste en el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos de la vasculatura preexistente (2) y suministra oxígeno y nutrientes adecuados para apoyar la proliferación tumoral y más metástasis (3). La evidencia acumulada indica que Luad es propensa a metástasis hipervasculares, lo que sugiere que la terapia antiangiogénica sería una buena estrategia de tratamiento. Awough Drogas antiangiogénicas y estrategias de terapia combinada (4,5,6) Han atraído una atención significativa en las últimas décadas, la mala eficacia o la resistencia a los medicamentos aún obstaculizan la progresión terapéutica. Por lo tanto, un análisis adicional de la señalización de la angiogénesis involucrada en el crecimiento y la metástasis de LUAD sería un beneficio para el tratamiento clínico de los pacientes con LUAD.
Profilin (PFN), una proteína de unión a actina expresada ubicuamente pero altamente conservadora, es crutal para múltiples procesos celulares, incluida la proliferación celular y la apoptosis (7), migración y invasión celular (8), adhesión celular y transición epitelial-mesenquimal (EMT), resistencia a los medicamentos de la quimioterapia (9) y angiogengsis (10). Debido al empalme alternativo, hay cuatro isoformas, Profilina 1, 2, 3 y 4. Profilina 2 (PFN2) está fuertemente regulada en casi todos los tipos de tumores y altamente correlacionada con la transición epitelial-mesenquimal mediada por TGF-β (EMT) y las metástasis en tumores diversos, como el cáncer colectal11), cáncer de cabeza y cuello (12), y cáncer de mama triple negativo (8). Más importante aún, PFN2 podría promover el crecimiento del cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), la metástasis y la angiogénesis a través de exosomas (10). Al igual que sus compañeros miembros de la familia, PFN2 posee tres dominios, a saber, un dominio de unión a actina, un dominio de unión a fosfoinositidas y un dominio de unión a Poly-L-Proline. Entre ellos, el dominio de unión a poli-L-prolina formado por las hélices de perfiles N-terminales y C-terminales permite que PFN2 interactúe con las proteínas de la plétora, lo que hace que funcione como un centro que controla una red compleja de interacciones moleculares (13, 14). Por lo tanto, especulamos que PFN2 podría acompañar a su socio para promover la angiogénesis en Luad, sin embargo, no ha sido bien investigado.
La evidencia acumulada indica que la glucólisis aeróbica ayuda a las células cancerosas a convertir grandes cantidades de glucosa en lactato en presencia de oxígeno para proporcionar nutrientes para facilitar el crecimiento tumoral y la metástasis. La piruvato quinasa M2 (PKM2) es una enzima limitadora de la velocidad clave en la glucólisis, catalizando la conversión de fosfoenolpiruvato (PEP) y ADP en piruvato y ATP (15). En el citoplasma, PKM2 existe en una forma de homotetrámero que actúa como una fosfotransferasa (16,17,18), o en una forma de homodímero de baja actividad que actúa como un coactivador transcripcional (10, 19, 20). Para responder al estímulo aguas arriba, como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), PKM2 se transloca inmediatamente del citoplasma al núcleo para actuar como una fosfotransferasa y/o coactivador transcripcional. Estos roles duales hacen que PKM2 sea un objetivo prominente en la investigación de tumores (21, 22). Además, PKM2 también está regulado principalmente en las células tumorales, y tiene un papel positivo en la progresión tumoral y la angiogénesis.
En este estudio, utilizamos el modelo de angiogénesis basado en gotas para simular la angiogénesis hipóxica tumoral hipóxica y revelamos la angiogénesis potenciada por PFN2 mediada por PKM2 por sus interacciones proteína-proteína, lo que mejora la translocación nuclear de PKM2 y promueve la angiogénesis tumoral por la hipoxia NF-κB/HIF-α-α Signating Rathway, con la región nuclear de VE VEVE. Basado en estos hallazgos, nuestro estudio ilustró el nuevo papel de PFN2 en la regulación de la angiogénesis, proporcionando nuevos objetivos de terapia para el tratamiento con LUAD.
Métodos
Cultivo celular
Las líneas celulares de NSCLC humanas se cultivaron en RPMI 1640 suplementadas con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina (P/S). Las células HEK293T se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco de alta glucosa (DMEM) suplementado con FBS al 10%. Las células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HPMVEC, Sciencell, EE. UU.) Se cultivaron en medio de células endoteliales (Sciencell) suplementadas con 5% de FBS y 100 U/ml de P/S. Solo se usaron HPMVEC en los pasajes 6–8 en nuestros experimentos. Las líneas celulares se autenticaron comparándose con la base de datos STR. Todas las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contenía una incubadora de CO2 al 5% y se pasó cada 2-3 días.
Inmunohistoquímica (IHC)
Microarray de tejidos de adenocarcinoma de pulmón humano y tejidos normales adyacentes emparejados (HLUGA180SU06) y tejidos de adenocarcinoma de pulmón (HLuga120pg01) se adquirieron de la compañía de biotecnología de Shanghai Outdoi (Shanghai, China). Las secciones de los tejidos humanos o de ratones embebidos en parafina se tiñeron con anticuerpos como se indica en el texto. La tinción se calificó de acuerdo con la intensidad de la tinción (negativo: 0 puntos; débil: 1 punto; moderado: 2 puntos; y fuerte: 3 puntos) multiplicado por el porcentaje de células teñidas (porcentaje de células positivas: ≤25%: 1 punto; 26–50%: 2 puntos; 51–75%: 3 puntos; ≥75%: 4 puntos). Los puntajes de <6 se consideraron de baja expresión, y las puntuaciones de ≥ 6 se consideraron de alta expresión.
Infección y transfección lentiviral
Las células se sembraron en una densidad de 4 × 105/60 mm de plato, 18 h antes de la transfección. La transfección transitoria se realizó utilizando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.) De acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la transfección estable, las células se infectaron con lentivirus y se seleccionaron usando puromicina (5 µg/ml) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La eficiencia de la transfección se determinó utilizando la transferencia Western.
Escherichia coli que contiene los plásmidos HA-PFN2, HA-PFN2-MUS y Flag-PKM2 se adquirieron de Longqian Biotech (Shanghai, China). Las construcciones lentivirales y de plásmido para la eliminación de PFN2 (HU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-PURO) se adquirieron de Genechem (Shanghai, China).
Viabilidad celular y ensayo de formación de colonias
La viabilidad celular se evaluó utilizando el ensayo Kit-8 (CCK-8) de conteo de células (MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EE. UU.) Según las instrucciones del fabricante. Para los ensayos de formación de colonias, las células se sembraron en placas de 6 pocillos (400 células/pocillo) y permiten proliferar durante dos semanas. Para la formación de colonias, se cosecharon 103 células y se colocaron en placas de 6 pocillos. Las colonias obtenidas se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con violeta cristal al 1%. Las colonias (> 50 células) se contaron manualmente.
Análisis de apoptosis celular
El ensayo de apoptosis se realizó utilizando un kit de detección de apoptosis anexina V-FITC (C1062, Beyotime) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células teñidas se analizaron utilizando un citómetro de flujo de Advanteon Novocyte (Agilent Novocyte Advanteon).
Ensayo de formación de tubo
Matrigel con factor de crecimiento reducido (100 µl/pocillo) se agregó en placas de 48-Microwell y se colocó a 37 ° C durante 30 minutos para solidificarse. A continuación, 4 × 104 células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HPMVEC) se resuspendieron en medios acondicionados de diferentes tipos de células y se agregaron a las microondas. Las células se incubaron durante 6 h.
Se estableció un modelo de angiogénesis tumoral basado en gotas como se describió anteriormente23. Las células tumorales (TC) se cultivaron 3D en matrigel, mientras que las HPMVEC se cultivaron como monocapa. Después de 24 h, se formó un cocultivo fusionando las dos gotas de las células a través de un movimiento horizontal recíproco del capilar entre las dos gotas. Tinción de inmunofluorescencia de roDamina faloidina utilizada para evaluar la formación de tubos.
Modelo de xenoinjerto
Los ratones desnudos Balb/C (7 semanas de edad) se obtuvieron de liaoning Changsheng Biotechnology Co. Ltd. (Shenyang, China). Se permitió que los xenoinjertos tumorales crezcan durante 3 semanas. Los tumores se midieron cada 3 días con pinzas y se calcularon usando la siguiente fórmula: A2 × B × 0.5, donde A es el diámetro más pequeño y B es el diámetro perpendicular a a. Los tumores fueron extirpados y pesados, y se prepararon en FFPE (4 μM) para un análisis posterior por IHC.
Análisis de transferencia Western
Las muestras de proteínas se electroforesis en SDS-PAGE y se transfirieron a las membranas de fluoruro de polivinilideno (Merck, EE. UU.), Luego se inmunotransferieron …
(Tagstotransilate) Profilina 2 (T) piruvato quinasa M2
