La inhibición de PI3Kγδ suprime características clave de la enfermedad en un modelo de asma en ratas

Resumen

Antecedentes

Dos isoformas de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K), p110γ y p110δ, se expresan predominantemente en los leucocitos y representan objetivos terapéuticos atractivos para el tratamiento del asma alérgica. El objetivo del estudio fue evaluar el impacto de la administración de un inhibidor de PI3Kγδ inhalado (AZD8154) en un modelo de asma en ratas.

Métodos

En primer lugar, comprobamos que el compuesto herramienta, AZD8154, inhibía las quinasas PI3K γ y δ de rata mediante ensayos basados ​​en células de rata. Posteriormente, se realizó un estudio temporal en un modelo de asma en ratas para evaluar la actividad de PI3K en el pulmón y cómo se asocia temporalmente con otras vías de transcripción clave y características similares al asma del modelo. Finalmente, se evaluó el impacto en la dosis de AZD8154 en los pulmones sobre la participación del objetivo, la especificidad de la vía, la inflamación de las vías respiratorias y los cambios en la función pulmonar.

Resultados

Los datos mostraron que AZD8154 podía inhibir las isoformas γ y δ de PI3K de rata y, en un modelo de asma alérgica en ratas, la vía PI3K se activó en el pulmón. La administración intratraqueal de AZD8154 provocó una supresión relacionada con la dosis de activación de la vía PI3K (reducción de pAkt) y, a diferencia del tratamiento con budesonida, las vías STAT y NF-κB no se vieron afectadas por AZD8154. La supresión de la vía PI3K provocó una marcada inhibición de la inflamación de las vías respiratorias y una reducción de los cambios en la función pulmonar.

Conclusión

Estos datos muestran que un inhibidor dual de PI3Kγδ suprime características clave de la enfermedad en un modelo de asma en ratas en un grado similar a la budesonida e indican que la inhibición dual de PI3Kγδ puede ser un tratamiento eficaz para las personas que padecen asma alérgica.

Introducción

El asma es una enfermedad inflamatoria crónica, heterogénea de las vías respiratorias que afecta a hasta 300 millones de personas en todo el mundo (1). Las terapias actuales tienen como objetivo lograr el control sintomático utilizando corticosteroides inhalados «estándar de oro» (2). Sin embargo, hasta el 50% de los asmáticos no logran el control a pesar de la terapia con dosis altas, y la terapia con dosis altas se asocia con un mayor riesgo de efectos secundarios no deseados (3,4,5,6). Como tal, se justifican terapias inhaladas novedosas que estén más dirigidas a los mecanismos que impulsan la enfermedad.

La fosfoinositida-3-quinasa (PI3K) es una lípido quinasa multifuncional, que desempeña un papel fundamental en la mediación de una gran variedad de funciones celulares como la proliferación, el metabolismo y la motilidad.7). Aunque inicialmente se asoció con el cáncer, la activación aberrante de las PI3K de clase I se ha asociado con varias enfermedades respiratorias crónicas como el asma.7,8,9). Las PI3K de clase I se activan mediante ligandos que se unen a un receptor acoplado a proteína G (GPCR) o al receptor tirosina quinasa (RTK), lo que conduce a la fosforilación del lípido plasmático fosfatidilinositol-4-5-bisfosfato (PIP).2) dando como resultado fosfatidilinositol-4-5-trifosfato (PIP3) (7, 9, 10). Las proteínas con dominios de homología de pleckstrina como las proteínas quinasas, Akt y la quinasa dependiente de fosfoinosítido (PDK) 1 se congregan en los sitios de activación de PI3K mediante la unión directa a PIP.3. Unión de Akt y PDK1 a PIP3 conduce a la fosforilación de Akt por PDK1, induciendo la activación de varios mediadores críticos para el crecimiento y la proliferación.7, 9).

Las PI3K de clase I constan de una subunidad catalítica (p110) y una subunidad reguladora. La subunidad catalítica p110 de clase I tiene 4 isoformas distintas, y las subunidades p110γ y p110δ se expresan principalmente en leucocitos (7, 11, 12). Tanto p110γ como p110δ desempeñan papeles críticos en la regulación de la respuesta inmune innata y adaptativa (11, 12). La subunidad p110γ es crucial para la maduración y supervivencia de las células T (13). Los estudios han demostrado que p110δ es crucial para mediar la función de las células B, la activación y la proliferación de las células T (14).

En el contexto del asma, apuntar a PI3K es atractivo ya que desempeña un papel fundamental en el impulso de muchas de las características fisiopatológicas que provocan la enfermedad. Los estudios in vitro han demostrado que la activación de PI3K desempeña funciones críticas en la contracción, proliferación y producción de numerosas quimiocinas del músculo liso de las vías respiratorias.7, 15,dieciséis,17). Además, la activación de PI3K también es importante con respecto a la secreción de moco de las células epiteliales de las vías respiratorias.18). Con respecto a la inflamación, la activación de PI3K también es crucial para impulsar la activación, desgranulación y liberación de citoquinas de los granulocitos.19,20,21). Estas observaciones se han demostrado funcionalmente con modelos in vivo de asma que muestran un papel crucial para PI3K en el impulso de la hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR) y la inflamación de las vías respiratorias (22,23,24). Curiosamente, la vía PI3K puede ser un objetivo útil para el asma grave, ya que los ratones con deficiencia de PI3Kγ tienen una remodelación reducida de las vías respiratorias; y la supresión de PI3K restableció la sensibilidad a los esteroides en un modelo de asma resistente a los esteroides (22).

Actualmente se están investigando varios inhibidores de PI3K para su uso en el asma y otros trastornos respiratorios (7, 25, 26). Los inhibidores de Pan-PI3K como wortmannin y LY294002 son inapropiados debido a su toxicidad o perfiles farmacocinéticos (PK) deficientes (25). Como tal, el enfoque se ha desplazado hacia los inhibidores específicos de isoformas γ y/o δ (25). El inhibidor oral de PI3Kγδ, duvelisib, se ha investigado en ensayos clínicos sobre asma que mostraron efectos beneficiosos, pero no se ha producido un mayor desarrollo debido potencialmente al perfil deficiente de efectos secundarios (27). Nemarisilib es un inhibidor de PI3Kδ inhalado que se evaluó recientemente en ensayos clínicos sin mejoría en los síntomas del asma y con un aumento asociado en la propensión a la tos (28). Estos datos pueden sugerir que un inhibidor dual inhalado puede ser un mejor enfoque terapéutico.

Por lo tanto, nuestro objetivo fue evaluar el potencial farmacológico de un inhibidor de PI3Kγδ inhalado, AZD8154, en un modelo establecido de asma en ratas determinando el impacto en la participación del objetivo (TE), la inflamación y la respuesta asmática tardía (LAR).

Métodos

Ensayos in vitro de activación de PI3Kγ y δ después de la administración del inhibidor de PI3Kγδ, AZD8154

Ensayo PI3K γ (29): se recogió sangre completa de rata Sprague Dawley macho en tubos recubiertos con heparina y se pretrató (1 hora, 37 °C, 5 % de CO2) con vehículo DMSO o inhibidores de PI3K seguido de estimulación con Rat CXCL1/CINC-1 (515-CN-050, R&D) a 500 ng/mL (EC80 determinado en casa; 1 hora, temperatura ambiente). A continuación, las células se tiñeron con bloque Fc (550,273, BD bioscience, 1:100; 20 minutos, RT), CD45R-B220-PeCy7 (HIS24) (25–0460-82, eBioscience, 1:100), CD43-PE ( W3/13) (202,812, Biolegend, 1:100), HIS48-FITC (11–0570-82, eBioscience, 1:100), CD11b-APC (562,102, BD Bioscience, 1:100). Las células se lisaron y fijaron con solución de lisado BD FACS (349,202, BD Biosciences; 45 minutos, RT) antes de la adquisición de FACS (BD LSRFortessa™). Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo 9.9 (TreeStar). Estrategia de selección FACS: linfocitos (FSC-A vs SSC-A), exclusión de dobletes (FSC-W vs FSC-H), identificación de neutrófilos B220-, HIS48hi, CD43hi, SSC-Ahi, geom. MFI para CD11b en neutrófilos. CI50 Los valores se determinaron en Graph Pad mediante un ajuste no lineal de los datos de transformación logarítmica: inhibidor logarítmico frente a respuesta, pendiente variable, 4 parámetros. La fracción libre en sangre total diluida se calcula mediante la siguiente ecuación: ({boldsymbol{fu}}^{prime }=frac{boldsymbol{DF}cdot {boldsymbol{fu}}_{boldsymbol{b}}}{1+left(boldsymbol{ DF}-1right)cdot {boldsymbol{fu}}_{boldsymbol{b}}}) donde fu' es la fracción no unida en sangre total diluida; fub es la fracción no unida en la sangre total sin diluir; DF es el factor de dilución. Fracción libre en 100% sangre total (fub) se calcula como fupag/BP, donde fupag es la fracción no unida en plasma no diluido determinada experimentalmente y la PA es la relación de partición del fármaco entre sangre y plasma determinada experimentalmente. 1.

Tabla 1 Fracción libre de compuestos en sangre total

Ensayo PI3K δ (30): la suspensión de células individuales se obtuvo del bazo de una rata Sprague Dawley macho; Las células se cultivaron en RPMI que contenía FBS al 10% inactivado por calor, pretratado (1 hora, 37 ° C, 5% de CO2) con vehículo DMSO o inhibidores de PI3K, seguido de estimulación con AffiniPure F(ab')2 Fragmento de IgM anti-rata de cabra, específico de cadena μ, Jackson Immunoresearch (112–006-075) a 5 μg/mL (EC80 determinado en casa; 20 a 22 horas). Luego, las células se lavaron con tampón FACS (2% FBS, EDTA 2 μM) y se tiñeron (15 minutos, 4 °C) con bloque Fc (1:100, 550,273, BD bioscience), kit de tinción de células muertas Aqua fijable LIVE/DEAD. (L34957, Invitrogen, 1:300), CD45R (B220)-PeCy7 (HIS24) (25–0460-82, eBioscience, 1:100), CD3-AF647 (IF4) (201,408, Biolegend, 1:100), CD86 -FITC (24F) (200,305, Biolegend, 1:50). Las células se adquirieron en el citómetro de flujo (BD LSRFortessa™) y se analizaron utilizando el software FlowJo 9.9 (TreeStar). Estrategia de selección FACS: linfocitos (FSC-A vs SSC-A), exclusión de dobletes (FSC-W vs FSC-H), células vivas (Aqua-530-), identificación de células B CD3- B220 + % de células B positivas para CD86 . CI50 Los valores se determinaron en Graph Pad mediante un ajuste no lineal de los datos de transformación logarítmica: inhibidor logarítmico frente a respuesta, pendiente variable, 4 parámetros. La fracción no unida en el ensayo in vitro se calcula utilizando la siguiente ecuación: ({boldsymbol{fu}}^{prime }=frac{boldsymbol{DF}cdot {boldsymbol{fu}}_{boldsymbol{p}}}{1+left(boldsymbol{ DF}-1right)cdot {boldsymbol{fu}}_{boldsymbol{p}}}) donde fu' es la fracción no unida en los medios de ensayo; fupag es la fracción no unida determinada experimentalmente en plasma humano sin diluir; DF es el factor de dilución (diferencia en veces entre la concentración de proteínas en plasma humano y los medios de ensayo, utilizando una concentración de albúmina de 600 μM (40 g/L) para plasma sin diluir). 2.

Tabla 2 Fracción libre de compuestos en sangre total

Modelo de asma alérgica en ratas para la caracterización temporal de las características clave de la enfermedad y el tratamiento con corticosteroide, inhibidor de PI3Kγδ, AZD8154

Se obtuvieron ratas macho adultas Brown Noruega de Charles River Alemania con un peso corporal en el intervalo de 250 a 300 g. Los animales se alojaron en jaulas ventiladas individualmente con temperatura controlada en grupos de 4 con comida y agua proporcionadas ad libitum…

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