Resumen
Antecedentes
Recientemente se aprobó en Japón la inhalación repetida del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) como tratamiento para la proteinosis alveolar pulmonar autoinmune. Sin embargo, los efectos fisiológicos y patológicos detallados de la inhalación repetida a largo plazo, especialmente en dosis crecientes, aún no están claros.
Métodos
En este estudio de seguridad crónica, administramos a 24 monos cynomolgus (Macaca fascicularis) de 2 a 3 años de edad sargramostim en aerosol (un GM-CSF humano recombinante derivado de levadura (rhGM-CSF)) quincenalmente durante 26 semanas en cuatro grupos de dosificación (0, 5, 100 y 500 µg/kg/día). Medimos la concentración sérica de anticuerpos contra GM-CSF (GM-Ab) mediante un ELISA y evaluamos la capacidad neutralizante de GM-Ab utilizando la línea celular TF-1 dependiente de GM-CSF. Sometimos muestras de tejido pulmonar tomadas de todos los monos a las 27 semanas a una evaluación histopatológica utilizando un anticuerpo monoclonal específico de sargramostim para detectar la localización del sargramostim residual.
Resultados
Todos los animales mantuvieron una buena condición corporal y mostraron un aumento de peso constante durante todo el estudio. Los análisis patológicos del pulmón revelaron la formación de tejido linfoide asociado a los bronquios inducido (iBALT) en el tracto respiratorio inferior, incluso con la dosis clínica de 5 µg/kg/día. Hubo una relación entre el número o el tamaño de BALT y la dosis de sargramostim o los niveles séricos de GM-Ab. Los análisis inmunohistoquímicos revelaron células productoras de GM-Ab en la región folicular de iBALT, con sargramostim residual en los folículos. Los recuentos de leucocitos se correlacionaron inversamente con los niveles de GM-Ab en los grupos de dosis altas. Además, el GM-Ab sérico de los animales tratados suprimió significativamente la actividad de proliferación de macrófagos alveolares tanto del Cynomolgus recombinante como del rhGM-CSF in vitro.
Conclusión
La inhalación repetida a largo plazo de sargramostim provocó la formación de iBALT en el tracto respiratorio inferior, incluso a la dosis clínica de 5 µg/kg/día, y el grado de formación de iBALT aumentó de manera dependiente de la dosis. El sargramostim inhalado se localizó en la región folicular de los nódulos iBALT, que pueden inducir la producción de GM-Ab.
Introducción
El factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) es una glicoproteína caracterizada como factor de crecimiento para linajes de granulocitos y macrófagos.1). Promueve la diferenciación de las células madre en granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos) y monocitos, desencadena su migración a diversos tejidos e induce su diferenciación en macrófagos maduros (2,3,4) y células dendríticas (5). El GM-CSF se libera a partir de macrófagos y células epiteliales y endoteliales. Apoya el sistema inmunológico local y mejora la función de los macrófagos y neutrófilos, y en el espacio alveolar, promueve la diferenciación terminal de los macrófagos alveolares, facilita el catabolismo de los surfactantes y ayuda a la digestión de sustancias extrañas (6).
Sargramostim, un GM-CSF humano recombinante derivado de Saccharomyces (rhGM-CSF), se diferencia ligeramente del GM-CSF humano natural en que el vigésimo tercer aminoácido (Arg) sustituye a Leu. Sargramostim estimula la proliferación de neutrófilos, monocitos y macrófagos después del trasplante de médula ósea y fue desarrollado y aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. como tratamiento para la granulocitopenia después de la quimioterapia contra el cáncer.
El efecto terapéutico de la inhalación de GM-CSF se ha investigado principalmente en el contexto del cáncer de pulmón metastásico (7). Un estudio de aumento de dosis que investigó el melanoma metastásico mostró que la inhalación de GM-CSF indujo linfocitos T citotóxicos de una manera dependiente de la dosis, y que los pacientes toleraron la administración de hasta 2000 µg de GM-CSF diariamente (8). La eficacia potencial de la inhalación de sargramostim como tratamiento para la proteinosis alveolar pulmonar (PAP) se sugirió por primera vez en estudios preclínicos en ratones con deficiencia de GM-CSF.9,10,11) y luego probado en ensayos clínicos abiertos para pacientes con PAP autoinmune (aPAP) (12,13,14) antes de ser confirmado por dos ensayos clínicos aleatorios doble ciego independientes (15, 16). Recientemente, el Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón aprobó el uso clínico de sargramostim como tratamiento por inhalación para aPAP. Estudios anteriores han informado que cinco días de inhalación de GM-CSF mejoraron la neumonía por COVID-19 en pacientes moderadamente enfermos (17,18,19) y sugieren que la inhalación a largo plazo de GM-CSF puede ser eficaz en el tratamiento de la enfermedad pulmonar por micobacterias no tuberculosas (20). Aunque la terapia por inhalación de GM-CSF se utilizará en el futuro para tratar diversas enfermedades respiratorias, aún no se ha realizado una evaluación detallada de sus efectos fisiopatológicos.
El tejido linfoide asociado a los bronquios (BALT) no se observa en adultos humanos (21) pero está presente en aproximadamente el 40% de las personas de 2 a 20 años (22). No está constitutivamente presente en todos los mamíferos; El 100% de los conejos y las ratas, el 50% de los cobayos y el 33% de los cerdos expresan BALT y está ausente en los gatos.21). A diferencia de las placas de Peyer, el BALT inducido (iBALT) a menudo surge en respuesta a la estimulación y se sabe que es un tejido linfoide terciario causado por la exposición a microorganismos exógenos o inflamación endógena de los pulmones (23). En humanos, iBALT se observa en pacientes con panbronquiolitis difusa (24), artritis reumatoide (25) y neumonía por hipersensibilidad (26). La composición estructural de iBALT se asemeja al tejido linfoide descrito en conejos y ratas, que se caracteriza por una densa encapsulación con linfocitos dispuestos en una estructura folicular que se extiende hacia una red de células estromales y se ubica debajo del epitelio de las vías respiratorias, que carece de cilios. BALT comparte similitudes estructurales con las placas de Peyer en el intestino delgado y el tejido linfoide asociado a la nariz. En las vías respiratorias, BALT se produce en la bifurcación traqueal, donde los antígenos inhalados pueden quedar atrapados (23). Se cree que iBALT actúa como un mecanismo de defensa inmune de la mucosa contra antígenos exógenos y microorganismos que invaden el tracto respiratorio.27). Chvatchko et al. observaron que ratones sensibilizados periféricamente expuestos a múltiples instilaciones intratraqueales (it) de ovoalbúmina exhibían la formación de centros germinales dentro del parénquima pulmonar, la aparición de células dendríticas foliculares portadoras de ovoalbúmina y la aparición de IgG1, IgE e IgA específicas de ovoalbúmina. -productoras de células plasmáticas (28). Sin embargo, faltan estudios publicados en animales que investiguen la formación de iBALT tras la inhalación prolongada de citocinas.
Antes del comienzo de un ensayo clínico destinado a investigar la eficacia y seguridad de la inhalación de sargramostim para aPAP leve a moderada (ensayo PAGE, 2016-2018), en 2015 se realizó un estudio no clínico en monos cynomolgus para confirmar la seguridad de la enfermedad crónica. administración de sargramostim para aPAP. Los monos mostraron un buen estado general después de la inhalación quincenal repetida de sargramostim hasta 100 veces la dosis clínica durante 26 semanas, pero el examen patológico realizado a las 27 semanas reveló un aumento de iBALT incluso con la dosis clínica de 5 µg/kg/día. Este estudio investigó las características de iBALT y discutió su importancia fisiológica.
Materiales y métodos
reactivos
Sargramostim se proporcionó a Nakata en la Universidad de Niigata en virtud de un acuerdo de transferencia de material firmado entre Sanofi Genzyme Corporation y la Universidad de Niigata.
animales
Los monos cynomolgus (Macaca fascicularis) fueron importados del Centro de Control de Calidad de Primates de Ina Research Filipinas. Para los experimentos del presente estudio se utilizaron machos de tres años (n = 12) y hembras de tres o cuatro años (n = 12). Se examinaron muestras teñidas con hematoxilina y eosina de los pulmones de otros cuatro monos sanos como muestras de control para los pulmones sin inhalación de sargramostim. Todos los experimentos con animales fueron realizados por Ina Research (Nagano, Japón), una institución totalmente acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio Internacional, con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, aprobación no. 15091). ) de Ina Research y la Junta de Ética Experimental con Animales (aprobación n.º 27-102-1) de la Universidad de Niigata. Todos los experimentos con animales siguieron la guía de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Publicaciones NIH No. 8023, revisada en 1978).
Asignación a grupos experimentales.
Cada uno de los monos se clasificó según su peso corporal y se asignó aleatoriamente a uno de cuatro grupos de dosificación (0, 5, 100 o 500 µg/kg/día) utilizando el sistema Provantis (Tabla 1). Los animales de cada grupo se numeraron aleatoriamente en cada grupo.
Tabla 1 Características demográficas de los animales de estudio.mesa de tamaño completo
Administración de sargramostim
Los cuatro grupos de dosificación estaban compuestos por seis monos cada uno (tres machos y tres hembras; Fig. 1. Cada animal fue sujeto en una silla de mono y se le aplicó una máscara de inhalación hecha a medida. La mascarilla se conectó a un nebulizador Pari LC Sprint Star (Pari, Starnberg, Alemania), a través del cual se administraron 1,5 ml de solución de sargramostim. La solución de sargramostim (0, 5, 100 o 500 µg/kg/día en una solución de tris/manitol/sacarosa a 1,2/40/10 g/l) se inhaló hasta que se agotó por completo. Este procedimiento se realizó diariamente en la primera semana de cada ciclo de dos semanas y la administración se suspendió durante la segunda semana. Estos ciclos de dos semanas se repitieron durante un total de 26 semanas.
Perfil de la cohorte del estudio que muestra el programa de administración de sargramostim en aerosol o vehículo a 24 monos cynomolgus. Los monos, de los cuales 12 eran machos y 12 hembras, se dividieron en cuatro grupos: vehículo y sargramostim a 5 µg/kg/día, 100 µg/kg/día o 500 µg/kg/día. El fármaco se administró por inhalación durante 13 ciclos durante 26 semanas. Se extrajo sangre de todos los monos al inicio y en los días 8, 28, 82 y 176 para realizar pruebas bioquímicas de sangre. Además, se realizaron autopsias…
