Resumen
Antecedentes
Las infecciones bacterianas pulmonares siguen siendo un sello distintivo de una variedad de enfermedades respiratorias, incluida la fibrosis quística (FQ), la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y las bronquiectasias no relacionadas con la FQ (NCFBE). Las infecciones crónicas persistentes en el pulmón, incluida P. aeruginosa, se caracterizan por períodos de estabilidad interrumpidos por exacerbaciones pulmonares agudas (PEx). Si bien los modelos de infección animal pueden replicar de manera confiable infecciones crónicas agudas y estables, actualmente ninguno replica los antecedentes fisiopatológicos «agudos sobre crónicos» apropiados necesarios para modelar PEx. Aquí, nuestro objetivo fue establecer un nuevo modelo de dos impactos de infección crónica por P. aeruginosa en el que los animales fueron sometidos por primera vez a una prueba de elastasa que inducía inflamación pulmonar y lesión reflejada en el pulmón con FQ/EPOC y posteriormente se infectaron con P. aeruginosa, utilizado por su similitud entre PEx en pacientes con FQ, EPOC y NCFBE.
Métodos
Los ratones fueron expuestos a 2 mg/kg de elastasa pancreática porcina (PPE) los días 1, 4 y 7 antes de la infección con 1 × 106 ufc/ratón P. aeruginosa cepa RP73, 3 días después de la exposición final al PPE. 2, 5 y 7 días después de la infección, se cuantificaron las lecturas microbiológicas e inflamatorias pulmonares.
Resultados
El EPP indujo un reclutamiento significativo de neutrófilos pulmonares junto con marcadores estructurales de lesión pulmonar característicos de la FQ, la EPOC y la NCFBE. En la cohorte de dos ataques, la eliminación bacteriana después de la infección por P. aeruginosa se vio significativamente afectada en los animales sometidos por primera vez a una exposición repetida a la elastasa. Esto estuvo acompañado de un reclutamiento y activación neutrofílicos exacerbados, lo que aceleró el daño pulmonar inducido por el EPI característico de los PEx.
Conclusiones
En conjunto, este modelo de dos resultados de infección pulmonar por P. aeruginosa después de una lesión pulmonar inducida por EPP replica cambios fisiopatológicos clave consistentes con PEx relevantes para pacientes con FQ, EPOC y NCFBE.
Fondo
Las infecciones bacterianas pulmonares son un sello distintivo de muchas enfermedades respiratorias, incluida la fibrosis quística (FQ) y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC).1), y siguen estando entre las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, con aproximadamente 2,5 millones de muertes atribuidas a infecciones del tracto respiratorio inferior en 2019 (2). Las infecciones bacterianas del tracto respiratorio inferior suelen clasificarse como infecciones agudas o crónicas. Las infecciones agudas se caracterizan como neumonía adquirida en la comunidad o en el hospital con patógenos oportunistas comunes que incluyen Streptococcus pneumoniae (S. penumoniae), Staphylococcus aureus (S. aureus), Klebsiella penumoniae (K. penumoniae) y Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) (3). Cuando se identifican tempranamente y se tratan adecuadamente en pacientes inmunocompetentes, estas infecciones agudas pueden responder rápidamente a la terapia con antibióticos dejando un daño residual limitado a los pulmones.4). Por el contrario, las infecciones persistentes y crónicas a menudo ocurren en pacientes con enfermedad respiratoria subyacente, y son comunes en pacientes con EPOC, FQ y bronquiectasias sin FQ (NCFBE) y generalmente se atribuyen a patógenos tanto gramnegativos como grampositivos, incluidos P. aeruginosa, S. aureus, S. pneumoniae y Haemophilus influenzae (H. influenzae) (5,6,7,8,9). Es importante destacar que estas infecciones pueden persistir durante meses o años a pesar del uso de antibióticos (4). Se cree que la capacidad de estos patógenos para colonizar las vías respiratorias y provocar una infección persistente es el resultado del daño pulmonar inducido por la inflamación (por ejemplo, hipersecreción de moco e inflamación neutrofílica persistente) que compromete la capacidad de los mecanismos de defensa normales del huésped para mantener la esterilidad del tracto respiratorio.1, 10, 11). Es significativo que en estas infecciones crónicas, la respuesta inmunológica a la infección de las vías respiratorias no se convierta en la respuesta adaptativa esperada, sino que se manifiesta como una respuesta neutrofílica continua similar a las observadas en las infecciones agudas.10) que conduce a un daño progresivo del tejido pulmonar y al deterioro de la función pulmonar (12, 13).
Las infecciones crónicas persistentes que experimentan pacientes con enfermedades respiratorias como FQ, NCFBE, EPOC y bronquitis crónica se caracterizan por períodos de estabilidad que están interrumpidos por períodos de empeoramiento agudo de los síntomas mediado por infección conocidos como exacerbaciones pulmonares agudas (PEx). Estos se asocian con un mayor deterioro respiratorio y, en última instancia, un aumento de la morbilidad y la mortalidad (14,15,16). Los PEx en pacientes con FQ, EPOC o NBCFBE pueden deberse a infecciones virales o bacterianas o, en determinadas circunstancias, a coinfecciones bacterianas-virales (9, 14, 15, 17, 18). La contribución de diferentes patógenos al desarrollo de PEx bacterianas agudas sigue siendo controvertida. Investigaciones anteriores sugieren que pueden ser el resultado de un aumento repentino en la densidad bacteriana del patógeno colonizador, la expansión clonal in situ de cepas existentes del mismo patógeno o mediante la adquisición de un organismo completamente nuevo.14), pero se requiere más investigación para aclarar esto. Sin embargo, dado que la tasa y la gravedad de la PEx siguen siendo un marcador importante de la gravedad de la enfermedad, sigue existiendo una clara necesidad insatisfecha de comprender más claramente los mecanismos que sustentan la susceptibilidad y el desarrollo de la PEx.
Los modelos animales se han utilizado durante mucho tiempo para estudiar infecciones bacterianas tanto agudas como crónicas.19, 20). En el contexto de las infecciones pulmonares por bacterias como P. aeruginosa y S. aureus, la mayoría de las infecciones respiratorias agudas se realizan en ratones inmunocompetentes o neutropénicos. Es importante destacar que los modelos inmunocompetentes están limitados por una alta mortalidad de 1 a 3 días, en gran parte debido a la alta carga bacteriana que se requiere para prevenir la eliminación bacteriana e inducir una infección tratable en ratones inmunocompetentes.21, 22), mientras que el uso de ratones neutropénicos no permite evaluar las contribuciones de la respuesta inmune del huésped (23). Mientras tanto, la mayoría de los modelos crónicos de infección pulmonar por P. aeruginosa implican la inoculación de bacterias en agentes inmovilizadores como perlas de agar/alginato para prevenir la eliminación bacteriana e imitar el crecimiento bacteriano observado en el moco de pacientes con FQ/NCFBE/EPOC (24,25,26). Si bien estos modelos replican las condiciones clínicas asociadas con infecciones crónicas estables, como la histopatología pulmonar, la infiltración de neutrófilos y la producción mejorada de citocinas (19), ninguno de estos modelos de infección respiratoria en su forma actual replica todos los cambios patológicos apropiados asociados con la aparición de PEx aguda. Es probable que esto se deba a la ausencia de lesión pulmonar previa o supresión inmune que se observa en pacientes con FQ/EPOC/NCFBE (1, 10), por lo que no replica la enfermedad «aguda sobre crónica» que son características de los PEx agudos. Estas enfermedades se caracterizan típicamente por una lesión pulmonar desencadenada por patrones moleculares asociados a daños (DAMP) y/o patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPS), lo que resulta en un reclutamiento y activación inapropiados de células inflamatorias y la posterior secreción de enzimas como la mieloperoxidasa (MPO), la elastasa de neutrófilos (NE) y las metalopeptidasas de matriz (MMP).1). Estos desencadenan la degradación de la matriz extracelular, propagando el daño de las vías respiratorias, junto con la metaplasia de células caliciformes y la hipersecreción de moco.27,28,29). Estos cambios en la fisiopatología pulmonar alteran la eliminación bacteriana y aumentan la infección pulmonar con patógenos oportunistas asociados con PEx.1). Es significativo que estos cambios inflamatorios crónicos subyacentes se pueden replicar utilizando modelos inflamatorios existentes, como el modelo de EPOC con humo de cigarrillo y el modelo de enfisema mediado por elastasa.29,30,31,32). Por lo tanto, en este estudio, buscamos caracterizar un nuevo modelo murino de dos ataques de infección crónica por P. aeruginosa en animales que habían recibido elastasa para inducir lesión pulmonar e inflamación que reflejara mejor los cambios fisiopatológicos observados en los pulmones de pacientes con FQ o EPOC.
Materiales y métodos
Mantenimiento y cultivo de bacterias para infección crónica.
La cepa RP73 de P. aeruginosa, que se obtuvo originalmente de un paciente con FQ con infección crónica que asistía a la Medizinische Hochschule de Hannover, Alemania, 16,9 años después del inicio de la infección, fue donada generosamente por la Dra. Alessandra Bragonzi del Instituto Científico San Raffaele, Milán, Italia (33). Después de la recolección y el cultivo iniciales, las bacterias se almacenaron a -80 °C en crioviales. Para todos los estudios, se tomó un asa de P. aeruginosa del stock a -80 °C y se sembró en una placa de agar tripticasa de soja (TSA) y se incubó a 37 °C durante la noche. Luego se inoculó una sola colonia en 10 ml de caldo de soja tripticasa (TSB) y se incubó durante 16 h a 37 °C en condiciones de agitación continua (120 rpm). Después de la incubación, el cultivo nocturno se diluyó colocando 2 OD de cultivo bacteriano (aproximadamente 1 × 109 ufc) en 20 ml de TSB fresco y se incubó durante 3 a 4 h para alcanzar la fase logarítmica de crecimiento. Una vez en la fase logarítmica, los cultivos bacterianos se centrifugaron a 2700 g durante 20 minutos a 4 °C. El sedimento bacteriano se resuspendió en PBS estéril y se diluyó a una concentración de trabajo de 2 x 107 ufc/ml (OD 0,1).
animales
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Ley de procedimientos (científicos) con animales de 1986 con enmienda de 2012 (PPL: P11C06933), con la aprobación ética local del King’s College de Londres. Los estudios en animales se informan de conformidad con las directrices ARRIVE. A lo largo de estos experimentos se utilizaron ratones macho C57Bl/6 (8 a 10 semanas) y se obtuvieron de Charles River (Harlow, Reino Unido). Los ratones se alojaron en jaulas con filtro superior en gabinetes ventilados en condiciones estándar de 22 ± 2 °C con un ciclo de luz:oscuridad de 12:12. Los ratones tuvieron acceso a la dieta Chow RM1(E) (Servicio de Dietas Especiales) y agua ad libitum en todo momento y se les proporcionaron virutas de madera, papel triturado y tubos de cartón para el enriquecimiento ambiental. Los ratones fueron asignados aleatoriamente a grupos experimentales para no conferirles ninguna «jaula…
