Resumen
Antecedentes
El adenocarcinoma de pulmón (LUAD) es el subtipo más común de cáncer de pulmón y una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo. El envejecimiento se ha convertido en un importante factor de riesgo para LUAD, y la evidencia sugiere que los cambios biológicos asociados con la edad pueden influir en el pronóstico. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes que vinculan el envejecimiento con la progresión tumoral y la resistencia al tratamiento no se comprenden completamente.
Métodos
Integramos datos transcriptómicos de cohortes LUAD para identificar genes relacionados con el envejecimiento que se expresan diferencialmente y se asocian con el pronóstico. Luego se utilizó la regresión de Cox para establecer una firma relacionada con el envejecimiento. Los pacientes se estratificaron según la firma y examinamos las diferencias de supervivencia y la expresión del factor de transcripción entre los grupos. In vitro, se indujo la senescencia celular en células A549 mediante el tratamiento con bleomicina y se evaluaron los cambios posteriores en la expresión genética, la actividad del factor de transcripción y la quimiorresistencia. Los estudios mecanicistas incluyeron tratamiento con inhibidores y interferencia de ARN para investigar la dependencia de la quimiorresistencia de vías de señalización específicas.
Resultados
Se identificó una firma relacionada con el envejecimiento de seis genes (H2AX, IGFBP1, CCL20, TFAP2A, TNFRSF11A, TNFRSF13C), estratificando a los pacientes en grupos de bajo y alto riesgo con distintos resultados de supervivencia general. Los pacientes de alto riesgo mostraron una supervivencia significativamente peor. Los análisis transcriptómicos y de proteínas revelaron que el factor de transcripción RELA estaba específicamente regulado positivamente en células senescentes y de alto riesgo. Los estudios funcionales confirmaron que la inducción de la senescencia celular aumentaba la expresión de RELA, la activación de la señalización de NF-κB y confería resistencia al paclitaxel. En particular, la eliminación genética o la inhibición de la señalización de NF-κB restablecieron la quimiosensibilidad en las células tumorales senescentes sin revertir el fenotipo senescente en sí.
Conclusiones
Este estudio estableció una firma relacionada con el envejecimiento clínicamente relevante para la estratificación del riesgo en LUAD y proporciona información mecanicista sobre cómo la senescencia celular impulsada por el envejecimiento promueve la quimiorresistencia a través de la activación de la vía RELA/NF-κB. Dirigirse a la señalización de NF-κB puede representar un enfoque terapéutico prometedor para superar la quimiorresistencia asociada a la senescencia y mejorar los resultados de los pacientes con LUAD.
Fondo
El cáncer de pulmón es el cáncer más frecuentemente diagnosticado y la principal causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo, siendo el adenocarcinoma de pulmón (LUAD) el subtipo predominante.1, 2). En las últimas décadas, el diagnóstico y el tratamiento de LUAD han mejorado. Sin embargo, la tasa de supervivencia a 5 años ha aumentado sólo modestamente y sigue siendo inferior al 15%, lo que indica que la etiología de LUAD es más sofisticada de lo que apreciábamos anteriormente.3). Por tanto, existe una necesidad apremiante de identificar biomarcadores y dilucidar los mecanismos moleculares.
El envejecimiento es un factor de riesgo importante para la LUAD, y la incidencia y la mortalidad aumentan considerablemente a medida que avanza la edad (4, 5). Los estudios de cohortes indican que las personas con envejecimiento biológico acelerado tienen una incidencia de cáncer de pulmón significativamente mayor en comparación con sus pares de la misma edad (6). Además, la asociación entre el envejecimiento y el pronóstico ha atraído considerable atención entre los investigadores. Zhang et al. y Ru et al. desarrollaron de forma independiente firmas relacionadas con el envejecimiento a través de distintos enfoques analíticos, logrando una estratificación precisa de los pacientes según el riesgo pronóstico (7, 8). Sin embargo, sus estudios se basaron en gran medida en evidencia basada en bioinformática sin mayor validación experimental del fenotipo o conocimientos mecanicistas sobre cómo el envejecimiento afecta el pronóstico de LUAD. Además, las firmas de expresión genética poseen inherentemente limitaciones, en particular debido a variaciones metodológicas en la secuenciación y los efectos de los lotes, lo que dificulta el establecimiento de un umbral universal para la clasificación de los pacientes. En consecuencia, las firmas relacionadas con el envejecimiento tienen un mayor potencial para la exploración mecanicista que la aplicación clínica directa. El envejecimiento se acompaña de inflamación crónica en el microambiente tisular, principalmente como resultado de la acumulación progresiva de células senescentes que secretan factores del fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP).9). La senescencia celular se refiere a un estado estable de detención del ciclo celular desencadenado por diversos factores estresantes, incluido el daño del ADN, el acortamiento de los telómeros y el estrés oxidativo. Las células senescentes están presentes en diversos tipos de tumores, donde la SASP persistente remodela activamente el microambiente del tumor.10). Esta remodelación contribuye a la angiogénesis, la transición epitelial-mesenquimatosa y la metástasis (11). Sin embargo, los fenotipos característicos y los mecanismos moleculares subyacentes inducidos específicamente por la senescencia celular en las células de cáncer de pulmón siguen siendo poco conocidos.
En este estudio, caracterizamos los patrones de expresión y el valor pronóstico clínico de la firma relacionada con el envejecimiento desarrollada con nuestra propia estrategia. Luego, identificamos factores de transcripción (TF) que se activaban de manera aberrante en el grupo de alto riesgo. Finalmente, establecimos un modelo de senescencia celular para validar la activación de estos TF, examinar los fenotipos malignos resultantes y dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes.
Métodos
Recopilación de datos
Descargamos datos del transcriptoma de muestras LUAD y muestras normales de la base de datos TCGA. Los datos clínicos correspondientes de la cohorte se obtuvieron simultáneamente. Las muestras (para la regresión de Cox) se excluyeron según los criterios: (1) Tejido paracanceroso normal; (2) Tejido fijado con paraformaldehído; (3) Múltiples muestras del mismo paciente. También descargamos un perfil de matriz de ARN y los datos clínicos correspondientes (GSE31210) (12) como conjunto de datos de prueba de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO). Se descargaron datos de ChIP-seq (GSE91020) para analizar el gen objetivo de RELA (13). Finalmente, el conjunto de datos de secuencia de ARN unicelular (scRNA-seq) GSE189357 (14) también se descargó para realizar más investigaciones.
Los genes relacionados con el envejecimiento (ARG) se obtuvieron del Aging Atlas Consortium (https://ngdc.cncb.ac.cn/aging/index) (15) y se muestra en la sTable 1. La lista de 786 TF humanos (sTable 2) se extrajo de la base de datos TRRUST (http://www.grnpedia.org/trrust) (16).
Evaluamos las diferentes expresiones de proteínas entre los tejidos LUAD y los tejidos normales utilizando cifras de inmunohistoquímica (IHC) obtenidas de la base de datos Human Protein Atlas (HPA) (https://www.proteinatlas.org/).
Análisis de secuencias de ARN y matrices de ARN a granel
Para la cohorte TCGA, los datos del recuento bruto de ARNm de cada muestra se recopilaron en una matriz y se normalizaron con el algoritmo ‘DESeq2’. Luego se calcularon los genes expresados diferencialmente (DEG) en tejido LUAD y tejido normal con valores de corte de |log2 veces de cambio| >1 y tasa de descubrimiento falso (FDR) <0,05. Para el conjunto de datos GEO, se utilizaron valores de expresión de ARN normalizados para calcular puntuaciones de riesgo en análisis posteriores.
Para investigar la función biológica de los genes, se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA). Primero obtuvimos términos de ontología genética (GO) significativamente enriquecidos y luego los visualizamos en un diagrama de crestas (|puntuación de enriquecimiento normalizado (NES)|>1, valor p <0,05 y valor q FDR <0,25). Los valores de P se ajustaron con los métodos de BH.
análisis de scRNA-seq
Se utilizó el paquete Seurat v4.3 para el análisis del conjunto de datos GSE189357. Las células de baja calidad se filtraron si expresaban menos de 200 genes, tenían más del 15% de lecturas mitocondriales o más de 5.000 recuentos de genes únicos. El análisis de componentes principales (PCA) se realizó en datos log-normalizados y escalados utilizando los 4000 genes variables principales. Luego, los primeros 10 componentes principales se utilizaron para la agrupación y se visualizaron mediante la incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (t-SNE). Las subpoblaciones celulares se anotaron según marcadores canónicos para diferentes tipos de células pulmonares. Las variaciones en el número de copias se infirieron con el paquete COPYKAT para distinguir las células tumorales de las no tumorales (17). Finalmente, se aplicó el algoritmo AUCell para calcular las puntuaciones de activación de la vía unicelular.
Análisis de secuencia de chip
Los archivos FASTQ sin procesar se descargaron y se verificó su calidad utilizando FastQC. El recorte del adaptador y la extracción de la base de baja calidad se realizaron con Trim Galore. Luego, las lecturas limpias se alinearon con el genoma humano de referencia (hg38) usando Bowtie2 (18). La llamada de picos se realizó con MACS2, que proporcionó ubicaciones de picos genómicos y puntuaciones de enriquecimiento mediante el conteo cuantitativo de la cobertura de lectura en cada región de picos. Los archivos BAM resultantes se convirtieron al formato BigWig y se visualizaron utilizando el UCSC Genome Browser.
Establecimiento de firma de pronóstico relacionada con el envejecimiento.
Mediante el análisis univariante de regresión de Cox, identificamos genes marcadamente relacionados con la supervivencia general (SG). Luego, los genes seleccionados se superpusieron con DEG y ARG para limitar la selección de genes. Se realizó una regresión de Cox multivariada para establecer una firma relacionada con el envejecimiento. El puntaje de riesgo de cada persona se calculó según la fórmula: puntaje de riesgo = Ʃ (βi × Expi). Expi representó el valor de la expresión mientras que βi fue el coeficiente del modelo de regresión. Los casos de LUAD se dividieron en dos grupos: grupos de bajo y alto riesgo.
Para el análisis de regresión LASSO (Operador de selección y contracción mínima absoluta), utilizamos el paquete R ‘glmnet’, estableciendo los genes candidatos como variables independientes y los datos de resultados del paciente como variable dependiente. El valor óptimo de λ se determinó mediante una validación cruzada de 10 veces. Con base en este modelo, identificamos cinco genes con coeficientes distintos de cero que se consideraron contribuyentes estadísticamente significativos a la predicción. El rendimiento predictivo del modelo de regresión resultante se evaluó mediante el análisis de la curva de características operativas del receptor (ROC).
Curvas de Kaplan-Meier (KM) y curvas ROC
El método KM se utilizó para evaluar la asociación entre el sistema operativo y la firma relacionada con el envejecimiento. También visualizamos el riesgo de supervivencia de TF único con curva KM. Además, realizamos análisis de curvas ROC dependientes del tiempo para evaluar el poder predictivo…
