La exposición temprana a aeroalérgenos de los ácaros del polvo doméstico aumenta la inflamación mieloide y el enfisema inducidos por el humo del cigarrillo en ratones

Resumen

Antecedentes

Los estudios longitudinales han identificado el asma infantil como un factor de riesgo de enfermedad pulmonar obstructiva (EPOC) y la superposición asma-EPOC (ACO), donde la limitación persistente del flujo de aire puede desarrollarse de manera más agresiva. Sin embargo, aún no se ha establecido un vínculo causal entre el asma infantil y la EPOC/ACO. Nuestro estudio tuvo como objetivo modelar la historia natural del asma infantil y la EPOC e investigar los mecanismos celulares/moleculares que impulsan la progresión de la enfermedad.

Métodos

La enfermedad alérgica de las vías respiratorias se estableció en ratones jóvenes C57BL/6 de tres semanas de edad utilizando extracto de ácaros del polvo doméstico (HDM). Posteriormente, los ratones fueron expuestos al humo del cigarrillo (CS) y HDM durante 8 semanas. El agrandamiento del espacio aéreo (enfisema) se midió mediante el método de intercepción lineal media. Se utilizó citometría de flujo para fenotipar las células inmunes del pulmón. La secuenciación masiva de ARN se realizó en tejido pulmonar. Se analizaron los compuestos orgánicos volátiles (COV) en el líquido de lavado broncoalveolar para detectar biomarcadores específicos de la enfermedad.

Resultados

La exposición crónica al CS indujo enfisema que aumentó significativamente con la exposición a HDM. El aumento de los cambios enfisematosos se asoció con una infiltración pulmonar de células inmunes más abundante que consiste en neutrófilos, macrófagos intersticiales, eosinófilos y linfocitos. Los análisis transcriptómicos identificaron una firma genética en la que los cambios específicos de la enfermedad inducidos por HDM o CS solos se conservaban en el grupo HDM-CS y revelaron además un enriquecimiento de Mmp12, IL33 y Il13y expresión genética consistente con una mayor expansión de macrófagos activados alternativamente. El análisis de VOC también identificó cuatro compuestos aumentados por la exposición al CS que paradójicamente se redujeron en el grupo HDM-CS.

Conclusiones

La enfermedad alérgica de las vías respiratorias en los primeros años de vida empeoró la patología pulmonar enfisematosa en ratones expuestos al CS y altera notablemente el transcriptoma pulmonar.

Introducción

El asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) son enfermedades pulmonares crónicas caracterizadas por obstrucción del flujo de aire que pueden presentar características patológicas e inmunológicas distintas. La EPOC generalmente se caracteriza por una obstrucción fija del flujo aéreo causada por enfisema, bronquitis crónica y/o remodelación fibrótica de las vías respiratorias distales.1), mientras que el asma se caracteriza por una hiperreactividad reversible de las vías respiratorias que responde altamente a los corticosteroides y broncodilatadores inhalados (2). Estas características clínicas pueden superponerse en los pacientes, lo que se denomina superposición asma-EPOC (ACO), lo que complica el diagnóstico y el tratamiento. Ahora es evidente que ciertos pacientes con EPOC pueden presentar niveles elevados de eosinófilos en esputo o sangre, y la EPOC puede desarrollarse más rápidamente en pacientes con antecedentes de asma o atopia.3).La coexistencia de características de asma y EPOC se asocia con tasas más altas de exacerbaciones y hospitalizaciones y una peor calidad de vida relacionada con la salud (CVRS) en comparación con el asma o la EPOC solos (4,5,6).

No está claro cómo se origina la ACO, pero las investigaciones actuales respaldan la ampliamente reconocida «hipótesis holandesa» de que el asma y la EPOC pueden compartir un origen común. Estudios longitudinales han identificado el asma infantil como un factor de riesgo importante para desarrollar EPOC en el futuro.7,8,9), donde se ha identificado que el deterioro de la función pulmonar en los primeros años de vida y el sexo masculino son los predictores más importantes del crecimiento pulmonar anormal y la disminución de la función pulmonar en la edad adulta temprana (9). En la cohorte de Tasmania, se encontró que los individuos en el cuartil más bajo de FEV1/FVC a los 7 años tenían muchas más probabilidades de desarrollar EPOC (odds ratio = 5,76) y ACO (odds ratio = 16,3) a los 45 años (7). En la cohorte del Programa de Manejo del Asma Infantil (CAMP), la edad a la que se hizo evidente un mayor riesgo de EPOC fue a los 26 años (9). Por lo tanto, eventos adversos como el asma infantil o la prematuridad pueden predisponer a los individuos a una disminución acelerada y persistente de la función pulmonar en la edad adulta, lo que resulta en una forma más agresiva de EPOC.10). No obstante, dado que el desarrollo clínico de la EPOC es multifactorial, aún no se ha establecido una relación causal directa. Varios estudios preclínicos han combinado modelos animales establecidos de EPOC, como la exposición a CS, y asma alérgica, como la ovoalbúmina o la sensibilización a HDM/desafío al modelo ACO, como lo resumen Tu et al (11). Sin embargo, no se han explorado las consecuencias de la exposición crónica al humo del cigarrillo en presencia de enfermedad atópica establecida durante las primeras etapas de la vida. Además, si bien estos estudios capturan aspectos fisiopatológicos importantes tanto del asma como de la EPOC, normalmente se centraron en la gravedad del asma y la hiperreactividad de las vías respiratorias en lugar del desarrollo de enfisema.11,12,13,14,15,dieciséis,17).

En este estudio, el objetivo principal fue investigar el impacto del asma infantil en el desarrollo de la EPOC después del tabaquismo durante la adolescencia hasta la edad adulta y descubrir los mecanismos fisiopatológicos subyacentes mediante análisis transcriptómico. Además, se realizó una evaluación metabólica en el líquido BAL para la identificación de biomarcadores a medida que están surgiendo marcadores de condensado del aliento exhalado (EBC) de enfermedades pulmonares crónicas (18). Nuestro estudio encontró que los ratones expuestos al aeroalérgeno HDM en una etapa temprana de su vida desarrollaron un peor enfisema tras la exposición al CS en la edad adulta. El análisis de secuenciación de ARN (RNA-Seq) reveló además una firma genética consistente con una población de macrófagos enriquecidos con MMP-12 patógena que se expandió en respuesta a la combinación de un aumento de mediadores tipo 2 (IL-4, IL-13 e IL-33) y CS. exposición.

Materiales y métodos

Experimentación animal

Todos los experimentos con animales fueron aprobados en la Universidad RMIT (AEC#24454) de acuerdo con el Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia (NHMRC) y las pautas de ARRIVE. En este estudio se utilizaron ratones macho, ya que los estudios clínicos longitudinales han demostrado que el sexo masculino y el asma infantil fueron los predictores más importantes de la disminución anormal de la función pulmonar en el futuro (9). Se adquirieron ratones C57BL/6 machos de 3 semanas de edad de la misma edad en Animal Resource Center (Perth, Australia). Los ratones primero fueron sensibilizados al extracto de ácaros del polvo doméstico (HDM (D. Pteronyssinus), Stellergenes Greer, EE. UU.; 100 µg/35 µL) o se les instiló solución salina (SAL) por vía intranasal, seguido de 4 pruebas diarias consecutivas de HDM (25 µg /35 µl). Después del período de sensibilización, se administró HDM (25 µg/35 µl) una vez por semana durante 8 semanas para mantener la enfermedad alérgica crónica de las vías respiratorias. Durante este período, los ratones también fueron expuestos al humo de 9 cigarrillos/día (CS) o al aire ambiente como se describió anteriormente (19).

Colección de tejidos

Los ratones se separaron en dos cohortes para la recolección de tejido (norte= 8 por grupo en ambas cohortes) y fueron descartados al final del protocolo mediante sobredosis de pentobarbital (ip, 240 mg/kg). Para la primera cohorte de ratones, se realizó un lavado broncoalveolar (BAL) lavando los pulmones con PBS helado utilizando una cánula 21G insertada en la tráquea y luego se recogieron los pulmones completos extrayendo cuidadosamente la tráquea y los tejidos conectivos. El lóbulo superior derecho se preparó inmediatamente para citometría de flujo y los lóbulos restantes se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y posteriormente se almacenaron a -80 °C. Para la segunda cohorte de ratones, los pulmones se inflaron con formalina tamponada neutra (NBF) al 10% a una presión hidrostática constante de 25 cm durante un mínimo de 20 minutos. Los pulmones inflados se extirparon y se fijaron durante otras 24 h mediante inmersión en NBF con la tráquea ligada.

Recuento celular diferencial BAL

El total de células viables recogidas de BAL se calculó utilizando un hemocitómetro. Luego se realizó Cytospin y los portaobjetos se tiñeron usando el kit de tinción rápida Hemacolor® (Sigma-Aldrich, EE. UU.) para el recuento celular diferencial (20, 21). El líquido restante se centrifugó y el sobrenadante (líquido BAL sin células) se recogió y almacenó a -80 °C para el análisis de compuestos orgánicos volátiles (COV).

Evaluación histológica del enfisema.

Se prepararon secciones transversales de los pulmones y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Intercepción lineal media (Lmetro) el análisis se realizó en secciones de pulmón teñidas con H&E de las que se tomaron imágenes en un escáner de portaobjetos Olympus VS120-SS (Olympus, Japón) para determinar y cuantificar el enfisema. Se analizaron cinco campos seleccionados al azar, con un aumento de 20X, en las regiones distales de cada sección de pulmón. Se creó una cuadrícula de 10 × 10, cada uno de los cuales mide 100 μm × 100 μm, y se superpuso en un área en cada campo que evita la vasculatura y las vías respiratorias. Luego se contó el número de paredes alveolares que cruzaban cada línea de cuadrícula horizontal. El lmetro se calculó restando primero la distancia en cada línea horizontal ocupada por los vasos sanguíneos y las vías respiratorias de la longitud total de todas las líneas de la cuadrícula horizontal, y luego dividiendo la distancia restante por el número total de intersecciones de la superficie alveolar contadas. El promedio Lmetro en las 5 cuadrículas se utilizó como L finalmetro de cada muestra de pulmón.

Extracción de ARN, conversión de ADNc y RT-qPCR.

El ARN total se extrajo de tejido pulmonar fresco triturado y congelado utilizando un kit RNeasy según las instrucciones del fabricante (Qiagen, Alemania). Luego, el ARN se convirtió en ADNc utilizando un kit High-Capacity RNA-to-cDNA™ (Life Technologies, EE. UU.). Luego se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real en el sistema de PCR Quantstudio™ 7 (Life Technologies, EE. UU.) en muestras de ADNc utilizando TaqMan™ Fast Advanced Master Mix (Life Technologies, EE. UU.) con los cebadores apropiados. Los genes se normalizaron contra Gaphd mediante el método delta-delta Ct como se describió anteriormente (22, 23).

Citometría de flujo

Los lóbulos pulmonares superiores derechos se extirparon y se digirieron en Liberase TM (Sigma-Aldrich, EE. UU.) a 37 ℃ durante 45 minutos en una incubadora con agitación. Luego se pasó el tejido digerido 5 veces a través de una aguja 21G y las células se sedimentaron mediante centrifugación a 4 ℃ durante 5 minutos. Los glóbulos rojos se lisaron incubando muestras en tampón de lisis ACK durante 1 minuto a temperatura ambiente, seguido de dilución con 10 ml de HBSS. Luego se obtuvo una suspensión de células individuales filtrando…

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