Resumen
Los cigarrillos electrónicos (e-cigs) se han introducido como una alternativa más segura a los cigarrillos combustibles tradicionales y han estado creciendo en popularidad. Todos los líquidos E-CIG contienen los compuestos portadores, la glicerina vegetal (VG), el propilenglicol (PG) y la nicotina, junto con diferentes sabores, pero los efectos de la inhalación de estos compuestos en las vías respiratorias no se entienden bien. Este estudio investiga los efectos de la exposición al CIG E-CIG en las células epiteliales de las vías respiratorias humanas primarias cultivadas en cultivos de interfaz de aire-líquido (ALI), que se centran específicamente en el aclaramiento mucociliar, el mecanismo principal de defensa del huésped del pulmón, por lo que los patógenos y las partículas atrapadas por MUCUS se eliminan por el latido unidireccional por las células ciliadas. Desarrollamos un sistema de exposición basado en el microcontrolador para examinar reproduciblemente los cambios celulares y moleculares en los cultivos de ALI a partir de la exposición al E-CIG. Aquí mostramos efectos heterogéneos dependientes del donante de diferentes sabores de CIG E-CIG en las células epiteliales de las vías respiratorias. Al examinar los efectos de los compuestos portadores sin sabor comunes a todos los cigarrillos electrónicos, encontramos que los cultivos de vías respiratorias Ali expuestas a PG: VG (relación 30:70) con cigarrillos electrónicos no saborizados al 5% muestran una reducción en la frecuencia del latido ciliar. Además, utilizando la microscopía electrónica de transmisión, identificamos defectos en la ultraestructura ciliar inducida por cigarrillos electrónicos no saborizados. El análisis fosfoproteómico descubrió cambios en la fosforilación de proteínas involucradas en la cadherina y la unión de actina y la vía de señalización Rho GTPasa, que están involucradas en la remodelación del citoesqueleto que puede influir en la estructura y función ciliar. En conjunto, nuestros hallazgos sugieren que la exposición a todos los cigarrillos electrónicos reduce el aclaramiento mucociliar.
Fondo
Los cigarrillos combustibles se han conocido durante décadas para reducir la eliminación mucociliar (MCC) y son el principal impulsor de lesiones premalignas y cáncer de pulmón (1). Además, son uno de los principales factores asociados con enfermedades respiratorias como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), el asma y la fibrosis pulmonar idiopática (IPF) (2,3,4). Durante la última década, han surgido muchas alternativas a los cigarrillos combustibles y se introdujeron los cigarrillos electrónicos (cigarrillos electrónicos) como una alternativa más segura a los cigarrillos combustibles y como una herramienta para dejar de fumar. La base del e-líquido en estos cigarrillos electrónicos se compone de propilenglicol (PG) y glicerina vegetal (VG) mezclada a diferentes proporciones, a las cuales se agregan compuestos saborizantes y nicotina. Los sabores de E-CIG pueden tener una variedad de perfiles de sabor, y pueden dividirse en múltiples clases químicas dependiendo de los grupos funcionales que contienen sus estructuras químicas, como cetonas, acetils, aldehídos, etc. (5). A pesar de la breve lista de ingredientes que comprenden líquidos electrónicos, los análisis químicos que utilizan métodos no dirigidos han identificado miles de productos químicos que se originan como contaminantes de los aromatizantes, componentes de E-CIG, envasado de e-líquido o están formados por la descomposición térmica de los solventes de e-líquidos a lo largo del tiempo ((6). Además, el proceso de calentamiento de la bobina dentro de los cigarrillos electrónicos produce metales tóxicos que terminan en e-líquidos y aerosoles (7, 8). Además, la creciente popularidad de los cigarrillos electrónicos de un solo uso y la falta de vías adecuadas para eliminar y reciclar sus baterías contribuyen a problemas ambientales debido a la lixiviación de nicotina y litio en agua y suelo (9).
Los pulmones están expuestos a partículas, toxinas y patógenos del medio ambiente con cada respiración. El epitelio de las vías respiratorias que recubren las vías respiratorias cartilaginosas ayuda a proteger los pulmones de estas exposiciones, creando una barrera química y física para limitar el paso de la materia extraña inhalada. Esta primera línea de defensa despeja continuamente las vías respiratorias de MCC (10, 11). MCC consta de dos componentes interdependientes: 1) cilios móviles similares al cabello en las células ciliadas que superan unidireccalmente de manera sincrónica y 2) la moco y las secreciones serosas de las células secretoras y las glándulas submucosas que atrapan los patógenos y escombros (12,13,14). La función sinérgica de estos dos componentes crea un sistema de defensa del host para los pulmones. Como resultado, los defectos en cualquiera de estos componentes comprometen la función de MCC y conducen a la patogénesis de los trastornos pulmonares crónicos.
El uso de E-CIG también se ha demostrado que impactan negativamente la salud pulmonar. Los estudios muestran que los usuarios de cigarrillos electrónicos experimentan un aumento en la resistencia de las vías respiratorias, lo que les dificulta respirar (15). También se ha demostrado que los cigarrillos electrónicos inducen inflamación pulmonar comparable a la observada en el asma o la bronquitis (16). El uso de cigarrillos electrónicos también conduce a una mayor susceptibilidad a las infecciones que provienen del daño a la función de barrera de las vías respiratorias (17). Se ha demostrado que los cigarrillos combustibles inducen alteraciones fisiológicas en la función y la actividad ciliar, las alteraciones morfológicas de los cilios y la disminución de la eliminación mucociliar (18,19,20,21,22,23,24). Similar a los cigarrillos combustibles, ha habido informes que vinculan el uso de cigarrillos electrónicos y el MCC desregulado. Varios estudios que utilizan modelos celulares han descrito cómo los cigarrillos electrónicos inducen una disminución en la viabilidad celular y el transporte de iones y un aumento en la viscosidad del moco (25,26,27). Los estudios en animales han encontrado que la exposición al E-CIG también disminuye la viabilidad celular y aumenta la producción de moco (28,29,30). Un estudio en ovejas encontró a los aerosoles E-CIG para reducir la velocidad del moco traqueal, que es una medición de la función de eliminación mucociliar (27). Muchos de estos estudios destacan el efecto de los cigarrillos electrónicos en el componente mucoso de MCC. El enfoque de nuestro estudio está en el componente ciliar y los efectos de la exposición al E-CIG en la frecuencia de latidos de cilios móviles (CBF) y la motilidad cilia. Para comprender los posibles efectos de los cigarrillos electrónicos en los cilios, es importante comprender primero la estructura y la función normales de los cilios. La estructura ciliar adecuada es crucial para la frecuencia de latido ciliar efectivo y MCC.
La ultraestructura primaria del cilio es un axonema que se compone de un par central de microtúbulos que está rodeado por nueve dobletes de microtúbulos externos (conocidos como 9 + 2) que están unidos al centro por proteínas radiales de radio (31). Los dobletes tienen brazos de dineína que son motores moleculares que permiten la paliza ciliar. Hay muchas instancias de axonemas anormales o desorganizados caracterizados por un par central separado o un par central faltante con un doblete externo «caída» en el centro del axonema para reemplazar el par central. Estos defectos ultraestructurales se utilizan para diagnosticar el trastorno genético, la discinesia ciliar primaria (PCD) (32). La PCD es causada por mutaciones en genes que afectan las estructuras ciliares. Los pacientes con PCD tienen MCC desregulado y abuildup de moco en sus vías respiratorias.
En este estudio, desarrollamos un sistema de exposición en vitro y demostramos que las exposiciones de E-CIG de corto y bajo nivel con diferentes sabores tienen un efecto heterogéneo en los tipos de células epiteliales de las vías respiratorias cultivadas en cultivos de interfaz de aire-líquido (ALI). Además, diferentes donantes respondieron de manera diferente a los diferentes sabores. Esta heterogeneidad en respuesta a los sabores nos llevó a estudiar cigarrillos electrónicos no saborizados, que contienen los componentes que están presentes en todos los cigarrillos electrónicos. Mostramos que los cigarrillos electrónicos sin sabor alteran la función de las células ciliadas y reducen su frecuencia de latido. La microscopía electrónica de transmisión reveló cambios ultraestructurales ciliares desde exposiciones de ALI de las vías respiratorias hasta cigarrillos electrónicos sin sabor. Luego realizamos análisis múltiples múltiples y encontramos cambios significativos mínimos en los niveles de transcripción y proteína después de la exposición de ALI a cigarrillos electrónicos no saborados. Sin embargo, identificamos cambios significativos en las modificaciones postraduccionales (PTM) que involucran fosforilación de proteínas. Un análisis posterior identificó posibles correlaciones entre estas alteraciones de PTM y la disfunción ciliar, revelando que las exposiciones agudas y de bajo nivel a los cigarrillos electrónicos pueden tener efectos perjudiciales en MCC, lo que lleva a una mala salud de las vías respiratorias.
Métodos
Adquisición de tejidos humanos
Se adquirieron grandes vías respiratorias y tejidos bronquiales de donantes pulmonares humanos normales no identificados después de los trasplantes de pulmón en el Centro Médico Ronald Reagan UCLA sin antecedentes previos de tabaquismo o enfermedad pulmonar. Además, se obtuvieron pulmones de investigación de donantes no trasplantables del Instituto Internacional para el Avance de la Medicina (IIAM). El tejido pulmonar humano desidentificado se adquirió bajo un protocolo aprobado por la junta de revisión institucional en la Facultad de Medicina David Geffen en UCLA (Exención# 21-000390).
Aislamiento de células madre basales de la vía aérea (ABSC)
Las abscas humanas se aislaron después de un método publicado previamente por nuestro laboratorio (33,34,35,36). Brevemente, las tráqueas se diseccionaron, limpiaron y se incubaron en 16U/ml de dispase durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las tráqueas se incubaron en 0,5 mg/ml de DNasa durante otros 45 minutos a temperatura ambiente. El epitelio se despojó bajo un microscopio de disección y se incubó en tripsina-EDTA al 0,1% durante 30 minutos de agitación a 37 ° C para generar una suspensión de una sola célula. Las células aisladas se pasaron a través de un colador de 40 μM y se criopreservaron usando medios de congelación de Bambanker (Fujifilm Wako Chemicals USA). Las abscas de dos a tres donantes se usaron para todos los experimentos.
Culturas de interfaz de aire -líquido (ALI)
Los transwell de 24 pocillos, 6.5 mM con insertos de membrana de poliéster de poro de 0.4 μM se recubrieron con 0.5 mg/ml de colágeno IV de placenta humana disuelta en ácido acético y se diluyeron en agua de grado celular a una proporción de 1:10. Se agregaron 100 μl a cada transwell y se dejó secar al aire. Las abscas se sembraron a 100,000 células por pozo directamente en transwells recubiertos de colágeno y se dejaron crecer en la fase sumergida del cultivo durante 4 a 5 días con 500 μl en la cámara basal y 200 μl en la cámara apical de Pneumacult ™ Ex-Plus Medium (Stemcell Technologies #05040). Los cultivos Ali se establecieron y cultivaron con solo 500 μl de medio de mantenimiento Pneumacult ™ Ali (Stemcell Technologies #05001) en la cámara basal. Los medios se cambiaron cada dos días y los cultivos se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 ° C con 5% de CO2. Las culturas son …
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