Resumen
Antecedentes
El desarrollo vascular pulmonar anormal plantea desafíos clínicos importantes para los bebés con displasia broncopulmonar (DBP). Aunque se han sugerido numerosos factores para controlar el desarrollo de los vasos sanguíneos pulmonares, los mecanismos subyacentes al papel de los ARN largos no codificantes (lncRNA) en este proceso aún no están claros.
Métodos
Se utilizó una matriz de lncRNA para medir la expresión diferencial de lncRNA en bebés prematuros con y sin BPD. La expresión de lncRNA-VSIG2-1:1 en pacientes con DBP y células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HPMEC) inducidas por hiperoxia se evaluó mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR). Se realizó un ensayo de hibridación fluorescente in situ (FISH) para detectar la localización subcelular de lncRNA-VSIG2-1:1. Se transfectaron de forma estable células endoteliales microvasculares pulmonares con vectores adenovirales para silenciar o sobreexpresar lncRNA-VSIG2-1:1. Los efectos de lncRNA-VSIG2-1:1 sobre las capacidades de proliferación, migración y formación de tubos de HPMEC sometidas a hiperoxia se examinaron mediante la realización del Cell Counting Kit-8 (CCK-8), ensayos de migración celular y formación de túbulos. Se realizó una secuenciación de ARN (RNA-seq) para determinar la correlación entre lncRNA-VSIG2-1:1 y fosfoinositida-3-quinasa (PI3K)/proteína quinasa B (AKT). Los niveles de proteína del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), p-PI3K, PI3K, p-AKT y AKT se determinaron mediante transferencia Western.
Resultados
La expresión de lncRNA-VSIG2-1:1 aumentó en pacientes con TLP y HPMEC tratados con hiperoxia. La inhibición de la expresión de lncRNA-VSIG2-1:1 promovió la capacidad de proliferación, migración y formación de tubos de las HPMEC, al tiempo que aumentó significativamente los niveles de VEGF, p-PI3K y p-AKT.
Conclusión
Nuestros hallazgos revelan que la supresión de la expresión de lncRNA-VSIG2-1:1 estimula la angiogénesis in vitro al inducir el inicio de la vía de señalización VEGF/PI3K/AKT. Esta observación puede ayudar al desarrollo de nuevos objetivos terapéuticos para el tratamiento del TLP.
Fondo
La displasia broncopulmonar (DBP) o enfermedad pulmonar crónica afecta notablemente la calidad de vida de los bebés prematuros supervivientes, especialmente aquellos con un peso al nacer extremadamente bajo (EBPN) <1000 g. Con el aumento de la supervivencia de los bebés con EBPN debido a la medicina moderna, la incidencia de TLP también ha aumentado (1,2,3). Las causas del TLP son multifactoriales y complejas, y la susceptibilidad genética y las diferencias en la regulación genética individual han atraído una atención significativa.4,5,6). Los cambios fisiopatológicos en pacientes con TLP incluyen predominantemente alvéolos simplificados y vasculatura dismórfica.7,8,9,10). Además, la alveolarización normal durante el desarrollo pulmonar requiere angiogénesis microvascular.11, 12). Actualmente, los mecanismos que subyacen al desarrollo vascular pulmonar en la TLP no se comprenden completamente y faltan estrategias adecuadas para el tratamiento de la TLP.
Los ARN largos no codificantes (lncRNA) son moléculas que contienen al menos 200 nucleótidos y no codifican proteínas. La evidencia emergente respalda la participación significativa de los lncRNA en diversos procesos celulares. Estudios recientes han demostrado el marcado papel que desempeñan los lncRNA en la angiogénesis y los trastornos vasculares (13,14,15), destacando así su potencial como biomarcadores cruciales y dianas terapéuticas para diversas enfermedades. Aunque las células endoteliales vasculares son importantes tanto para la reparación vascular como para la angiogénesis (16,17,18), su papel en la regulación y expresión de los lncRNA en la angiogénesis sigue siendo poco conocido.
La actividad del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) afecta considerablemente la angiogénesis y el desarrollo de los sistemas vasculares.19,20,21). Durante la angiogénesis, VEGF facilita el crecimiento y movimiento de las células en el endotelio y la formación de túbulos vasculares. Su papel en el desarrollo pulmonar es crucial y los cambios en su expresión se asocian con la aparición de DBP y enfermedad pulmonar crónica.22, 23). Un estudio previo ha establecido que VEGF puede controlar la expresión in vivo de genes inmunes a nivel local, lo que sugiere su posible aplicación en terapia exógena para diversas enfermedades pulmonares.24, 25). Además, varios estudios han presentado evidencia de las funciones esenciales de la fosfoinositida-3-quinasa (PI3K) y la proteína quinasa B (Akt) para promover la supervivencia de las células endoteliales y facilitar la angiogénesis. Estos mecanismos son inducidos por la activación de VEGF (26,27,28,29).
En el presente estudio, nuestro objetivo fue investigar la participación de lncRNA-VSIG2-1:1 en el desarrollo y patogénesis del TLP a través de la vía de señalización VEGF/PI3K/AKT para identificar una nueva diana terapéutica para el tratamiento de bebés afectados por TLP. En aras de la simplicidad, el lncRNA-VSIG2-1:1 se denominará VSIG2 en el futuro. Primero evaluamos la expresión de VSIG2 en bebés prematuros con TLP y comparamos los resultados con la expresión de VSIG2 en controles emparejados. A continuación, investigamos los mecanismos de acción moleculares funcionales y potenciales de VSIG2 in vitro. El examen de los datos de secuenciación de ARN (RNA-seq) reveló un marcado aumento en la expresión de genes asociados a la vía PI3K/AKT, cuyos niveles de expresión estaban regulados por VSIG2.
Métodos
Recogida de muestras de sangre.
Entre enero y diciembre de 2021, el Segundo Hospital Afiliado y el Hospital Infantil Yuying de la Universidad Médica de Wenzhou inscribieron a seis recién nacidos prematuros diagnosticados con TLP y seis recién nacidos prematuros sin TLP de la misma edad. El TLP se diagnosticó según los criterios de diagnóstico establecidos por las pautas de Salud y Desarrollo Humano Infantil (30). Se utilizaron tubos de extracción de sangre venosa que contenían ácido etilendiaminotetraacético para recolectar muestras de sangre completa, seguido de centrifugación (2000 rpm, 20 min) para la separación del plasma. El perfil de expresión de lncRNA se analizó utilizando Agilent-085202 LC Human ceRNAarray (versión lncRNA) proporcionado por LC Biotechnology (Hangzhou, China) Co., Ltd. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Clínica del Segundo Hospital Afiliado y el Hospital Infantil Yuying. de la Universidad Médica de Wenzhou (N.º de aprobación: LS 2021-K-311-03), y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los tutores del recién nacidos.
cultivo celular
Las células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HPMEC) utilizadas en este estudio se adquirieron de iCell Bioscience Inc. (Shanghai, China) y se cultivaron en un medio de matriz extracelular especializado. Este medio contenía un 10% de suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor y un suplemento de crecimiento de células endoteliales. Las células se mantuvieron a una concentración de CO2 del 5% y una temperatura de 37 °C.
Exposición a hiperoxia
Las pruebas de hiperoxia se realizaron dentro de una carcasa de plexiglás herméticamente sellada, en la que circulaba una mezcla de gases compuesta por 95 % de O2 y 5 % de CO2. Este aislamiento con camisa de agua protegió la cámara, que se mantuvo a 37 °C en una incubadora Forma Scientific™. Después de que el nivel de O2 en la cámara alcanzó el 95%, las células se introdujeron rápidamente en la cámara y se incubaron durante 48 h (31).
Transfección y tratamiento celular.
Se utilizaron vectores adenovirales para inhibir o sobreexpresar VSIG2, mientras que se construyeron vectores lentivirales para inhibir VEGF. Todos los vectores fueron adquiridos de Sangon Biotech Co., Ltd (Shanghai, China). Las secuencias de plásmidos (5′ → 3′) fueron las siguientes:
sh-VSIG2-1:1-1:
GGTGATAGCTACCACTTAATTCAAGAGATTAAGTGGTAGCTATCACCTTTTTT;
sh-VSIG2-1:1–2:
GAGGGAGAAACAGGATGAATTCAAGAGATTCATCCTGTTTCTCCCTCTTTTTT;
sh-VSIG2-1:1–3:
CCGTGTTCATTACCTTTGATTCAAGAGATCAAAGGTAATGAACACGGTTTTTT
sh-VEGF-1:
CGAGGCAGCTTGAGTTAAATTCAAGAGATTTAACTCAAGCTGCCTCGTTTTTT
sh-VEGF-2:
GATCCGCAGACGTGTAAATTTCAAGAGAATTTACACGTCTGCGGATCTTTTTT
sh-VEGF-3:
GAGCGGAGAAAAGCATTTGTTTCAAGAGAACAAATGCTTTTCTCCGCTCTTTTTT
Las células transfectadas se expusieron a un sistema de cultivo celular oxigenado durante 48 h antes de experimentos adicionales. Posteriormente, estos portadores se transfectaron en las células. La transfección se realizó utilizando Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante y en condiciones celulares adecuadas.
Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
El ARN total se extrajo de las células cultivadas y de las muestras de sangre utilizando el reactivo TRIzol (Beyotime, Shanghai, China). Se utilizó un espectrofotómetro Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific) para cuantificar las muestras. Se utilizó ReverTra Ace qPCR Master Mix (TOYOBO, Japón) para preparar el ADN complementario. El análisis cuantitativo en tiempo real basado en PCR se realizó utilizando un sistema de PCR en tiempo real rápido Applied Biosystems 7900HT con SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (TOYOBO, Japón). Se utilizaron las siguientes secuencias de cebadores (5′ → 3′):
Lnc-VSIG2-1:1-F: CAGGATTCTTTGGGCGGT;
Lnc-VSIG2-1:1-R: GACCGAAGAAGAACTGAGCATT;
VEGF-F: TCAGCGCAGCTACTGCCATC
VEGF-R: GTGCTGGCCTTGGTGAGGTT
GAPDH-F: TGGGTGTGAACCATGAGAAGT;
GAPDH-R: TGAGTCCTTCCACGATACCAA
Ensayo del kit de recuento celular-8 (CCK-8)
Se utilizó el CCK-8 (Beyotime, Shanghai, China) para evaluar la proliferación celular. Se sembraron un total de 3000 células en cada pocillo de placas de 96 pocillos y se incubaron durante 12, 24, 48 y 72 h. Posteriormente, se agregaron 10 µL del reactivo CCK-8 a cada pocillo y las placas se sometieron a incubación a 37 °C durante 1 h. Para determinar la viabilidad celular, se midió la absorbancia (densidad óptica (OD)) a 450 nm utilizando un lector de microplacas (Bio-Tek Instruments, Inc. Estados Unidos).
Ensayo de migración celular
La capacidad migratoria de las células se evaluó realizando un ensayo de rayado. En placas de seis pocillos, se sembraron 2 x 105 células y se incubaron durante 24 h. Después de un período de privación de suero de 4 h, creamos un rasguño lineal en la superficie de la monocapa celular usando una punta de pipeta de 10 µL. Posteriormente, se aplicó tres veces a las células una solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células se cultivaron durante 24 h adicionales en medio sin suero a 37 °C en presencia de 5% de CO2. Los resultados de la distancia de migración fueron…
