La disminución de la serpina C1 en vesículas extracelulares predice la respuesta al tratamiento con metotrexato en pacientes con sarcoidosis pulmonar

Resumen

Antecedentes

La sarcoidosis es una enfermedad granulomatosa sistémica de etiología desconocida que afecta principalmente a los pulmones. Se necesita tratamiento cuando los síntomas de la enfermedad empeoran y la función de los órganos se deteriora. En la sarcoidosis pulmonar, la prednisona y el metotrexato (MTX) son las terapias antiinflamatorias más comunes. Sin embargo, existe una gran variabilidad entre pacientes en la respuesta al tratamiento y actualmente faltan marcadores de respuesta predictivos.

Objetivo

En este estudio, investigamos el potencial predictivo de los biomarcadores en vesículas extracelulares (EV) aisladas del suero de pacientes con sarcoidosis pulmonar almacenado en biobancos antes del inicio de la terapia.

Métodos

En un descubrimiento se midieron las concentraciones de proteínas de un panel de prueba de cuatro proteínas de proteínas inflamatorias (norte= 16) y replicación (norte= 129) cohorte de pacientes con sarcoidosis y 47 controles sanos. La respuesta al tratamiento se definió como una mejora de la puntuación absoluta de > 5 % de la capacidad vital forzada (FVC) y/o > 10 % de difusión pulmonar de monóxido de carbono (DLCO) después de 24 semanas en comparación con el valor inicial (antes del tratamiento).

Resultados

Los niveles de proteína sérica difirieron entre las fracciones de EV y el suero, y entre los casos y controles de sarcoidosis. Las concentraciones de Serpin C1 en la fracción EV de partículas lipídicas de baja densidad fueron más bajas al inicio del estudio en el grupo de pacientes con una buena respuesta al tratamiento con MTX tanto en la cohorte de descubrimiento (pag= 0,059) y en la cohorte de replicación (pag= 0,032). EV Serpin C1 demostró ser un predictor significativo de respuesta al tratamiento con MTX (OR 0,4; pag= 0,032).

Conclusión

Este estudio muestra que las proteínas aisladas de vehículos eléctricos albergan una señal distinta y tienen potencial como nuevos biomarcadores de respuesta a terapia predictiva en la sarcoidosis.

Introducción

La sarcoidosis es una enfermedad granulomatosa sistémica de causa desconocida que afecta principalmente a los pulmones, los ganglios linfáticos intratorácicos, los ojos y la piel (1). El diagnóstico, el seguimiento y la predicción del curso de la enfermedad o la respuesta al tratamiento suponen un desafío en el tratamiento de los pacientes con sarcoidosis. Durante décadas, se han estudiado biomarcadores como la enzima convertidora de angiotensina (ECA) y el receptor de interleucina-2 soluble (sIL-2R) para guiar el tratamiento clínico, desafortunadamente con una sensibilidad y especificidad modestas.2, 3). El tratamiento farmacológico de la sarcoidosis se inicia para prevenir un mayor daño a órganos específicos o aliviar los síntomas. Los fármacos inmunosupresores e inmunomoduladores, más a menudo en forma de prednisona y metotrexato (MTX), son el tratamiento de primera y segunda línea. Sin embargo, al iniciar la terapia no es posible predecir de antemano la respuesta al tratamiento de cada paciente, mientras que una parte importante no muestra ningún beneficio de la terapia. La predicción personalizada de la respuesta al tratamiento es una necesidad clínica insatisfecha a la luz de la protección de los pacientes de la exposición a fármacos ineficaces y sus efectos secundarios.

La sarcoidosis se caracteriza por la formación de granulomas no caseosos, inflamación persistente y monocitos/macrófagos activados (4). Los macrófagos forman el núcleo del granuloma y producen citocinas y quimiocinas inflamatorias para atraer a los linfocitos, lo que genera un entorno inflamatorio.5). Estos macrófagos se originan a partir de monocitos circulantes derivados de la médula ósea que patrullan las células presentadoras de antígenos pero que tienen una función secundaria como reservorio para reponer el conjunto de macrófagos en los tejidos cuando sea necesario. Varios estudios han puesto de relieve un mayor estado inflamatorio de los monocitos en la sangre de pacientes con sarcoidosis (6,7,8,9). Este aumento del estado inflamatorio también puede inducirse a través de vesículas extracelulares (EV), como lo describieron previamente Wahlund et al. (9). Además, se encuentran más monocitos en la circulación de pacientes con sarcoidosis y estas células tienen la capacidad de activar otras células inmunes, no sólo a través de la interacción célula-célula sino también a través de vehículos eléctricos derivados de monocitos.10, 11). En conjunto, los vehículos eléctricos aislados del suero sanguíneo total pueden ser particularmente informativos en la sarcoidosis.

EV es un término general para todas las vesículas que se encuentran en los fluidos corporales, incluidos los exosomas, las microvesículas y los cuerpos apoptóticos. En la última década, se descubrió que los vehículos eléctricos pueden transferir funcionalmente moléculas entre células (12). Los vehículos eléctricos contienen ácidos nucleicos, lípidos y proteínas de las células liberadoras y, a menudo, se denominan biopsias líquidas (13, 14) que refleja el estado/patología de la célula liberadora. Las proteínas EV suelen estar mejor asociadas con la patología que las mismas proteínas que circulan libremente en la sangre (15). En la búsqueda de nuevos biomarcadores potenciales, ha habido un mayor interés en los vehículos eléctricos (dieciséis,17,18). Debido a la etapa relativamente nueva de este campo emergente de investigación, existe la necesidad de estandarizar tanto la metodología como la tecnología para poder validar los biomarcadores asociados a los vehículos eléctricos.19).

Para este estudio se utilizó un panel de proteínas EV bien establecido (20), desarrollado originalmente para predecir eventos cardiovasculares adversos. Este panel constaba de cuatro proteínas, CD14, Serpin G1, Serpin C1 y Cisteína C. Aunque las cuatro proteínas de este panel se utilizan principalmente en el campo de la cardiología, estas proteínas también participan en la inflamación y la coagulación (21,22,23,24,25,26,27). Por tanto, este panel de proteínas podría ser de interés en la evaluación de la inflamación y la predicción de la respuesta al tratamiento inmunosupresor en la sarcoidosis. Las proteínas se midieron originalmente en forma de múltiplex; sin embargo, para este estudio las proteínas se midieron por separado para investigar las asociaciones de las proteínas individuales con la respuesta al tratamiento.

En este estudio exploratorio, investigamos el potencial de los biomarcadores inflamatorios derivados de fracciones de EV aisladas en suero utilizando un panel bien establecido de proteínas previamente validadas en EV. El objetivo del presente estudio era triple. Primero, investigamos si existen diferencias en los niveles de biomarcadores inflamatorios entre los aislados de EV y el suero. En segundo lugar, investigamos si los biomarcadores derivados de EV difieren entre pacientes con sarcoidosis y controles sanos. En tercer lugar, evaluamos si estos biomarcadores inflamatorios predicen la respuesta al tratamiento en pacientes que usan prednisona o MTX.

Materiales y métodos

Pacientes

Se recolectaron muestras de casos y controles del biobanco de ILD del Hospital St. Antonius, examinando a todos los pacientes con sarcoidosis (norte= 2265) para la elegibilidad. Los casos se seleccionaron en función de la indicación del tratamiento pulmonar (disminución de la función pulmonar, disnea o fibrogénesis pulmonar), tratamiento con prednisona o MTX y presencia de suero recogido en los 6 meses anteriores al inicio del tratamiento. 98 pacientes con sarcoidosis fueron tratados con MTX y 69 pacientes con prednisona. Todos los pacientes eran adultos > 18 años con sarcoidosis diagnosticada según los criterios internacionales ATS/ERS/WASOG (1).

Las características iniciales (edad en el momento del diagnóstico, sexo, comorbilidades informadas en los registros médicos), la función pulmonar, el síndrome de Löfgren y las manifestaciones orgánicas se registraron hasta 2 años después del inicio del tratamiento. Según los resultados del ensayo SARCORT publicado recientemente (28), así como la puntuación del tratamiento de la sarcoidosis (29), una mejora de la puntuación absoluta de > 5 % de la capacidad vital forzada (FVC) y/o > 10 % de difusión pulmonar de monóxido de carbono (DLCO) después de 24 semanas en comparación con el valor inicial (antes del tratamiento) clasificó a un paciente como “respondedor” . Todos los demás pacientes fueron clasificados como «no respondedores».

Este estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y las directrices de BPC. El estudio fue aprobado por los Comités Unidos de Ética de Investigación Médica (MEC-U) del Hospital St. Antonius (R05-08A) y se obtuvo el consentimiento por escrito de todos los pacientes.

Cohortes de estudio

Primero se compuso la cohorte del descubrimiento, una cohorte de 16 casos de prednisona y 16 de MTX que se emparejaron lo mejor posible en edad, sexo, origen étnico e historial de tabaquismo. Para cada tratamiento, ocho pacientes respondieron y ocho pacientes no respondieron a la terapia. La cohorte de replicación estuvo compuesta por los 49 casos restantes de prednisona y 80 de MTX. En la cohorte de replicación, el grupo tratado con prednisona estuvo formado por 29 respondedores y 20 no respondedores, y el grupo tratado con MTX estuvo formado por 42 respondedores y 38 no respondedores. Además, se incluyeron 47 muestras de control sanas. El flujo de trabajo se resume en un diagrama de flujo en la Fig. 1.

Figura 1

Diagrama de flujo que muestra el procedimiento para la identificación de pacientes y su distribución en la cohorte de descubrimiento y replicación. En resumen, de 2265 pacientes con sarcoidosis y consentimiento informado para el biobanco de EPI, 161 pacientes cumplieron los criterios para ser incluidos en el estudio. Se seleccionó un total de 32 pacientes del mismo sexo y edad para la cohorte de descubrimiento. Los 129 pacientes restantes se incluyeron en la cohorte de replicación.

Se recogieron muestras de sangre antes de administrar cualquier tratamiento. El suero se aisló mediante centrifugación de tubos activadores de coágulos separadores de suero a 1800 g durante 5 minutos y se almacenó a -80 °C en el BIOBANK del Hospital St. Antonius hasta su uso posterior.

Aislamiento de vehículos eléctricos

El aislamiento de la fracción EV se basó en el protocolo de Dekker et al. (30); sin embargo, aquí se utilizó suero en lugar de plasma (consulte la descripción detallada en el material complementario). Los vehículos eléctricos se aislaron de 25 μl de suero con el uso de perlas magnéticas (Nanomag®-D simple, 130 mm (1:25) (Micromod). Para el aislamiento secuencial de las fracciones de sulfato de dextrano (DS) (MP Biomedicals, Illkrich, Francia) y cloruro de manganeso (II) (MnCl2) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). La presencia de vehículos eléctricos aislados utilizando esta técnica se confirmó previamente con microscopía electrónica y transferencia Western (30,31,32). Se obtuvieron diferentes fracciones de EV en suero mediante coprecipitación de EV con partículas lipídicas monocapa de baja densidad (fracción LDL) y con vesículas de membrana bicapa partículas lipídicas de alta densidad (fracción HDL). Realizado anteriormente…

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