Resumen
Antecedentes
Las infecciones microbianas, particularmente las causadas por el rinovirus (RV) y el virus sincitial respiratorio (RSV), son desencadenantes principales para las exacerbaciones del asma. Estos virus activan los receptores tipo Toll (TLR), iniciando una respuesta inmune innata. Para comprender mejor las exacerbaciones de asma inducida por microbianos, los modelos animales que imitan estrechamente las características pulmonares humanas son esenciales. Este estudio tuvo como objetivo evaluar las respuestas de las vías respiratorias en conejillos de indias expuestos a agonistas de TLR, simulando infecciones microbianas.
Métodos
Los agonistas poli (i: c) (TLR3), lipopolisacárido (LPS; TLR4) e imiquimod (TLR7), o la combinación de poli (i: c) e imiquimod (P/i) se administraron por vía intranasal una vez al día más de cuatro consecutivos días. El último grupo recibió inyecciones diarias intraperitoneales de dexametasona a partir de un día antes del desafío de los agonistas TLR. Las funciones respiratorias se midieron mediante pletismografía de todo el cuerpo y técnica oscilatoria forzada. Para su análisis se recogieron células y pulmones de fluido de lavado broncoalveolar (BALF) para su análisis.
Resultados
La exposición intranasal de LPS y P/I causó un aumento en la pausa mejorada (PENH) después del desafío, mientras que ni Poly (I: C) ni Imiquimod solo mostraron ningún efecto. Después de los desafíos de LPS, poli (i: c) o p/i, pero no imiquimod solo, indujo un aumento de los RR (resistencia del sistema respiratorio) y ERS (elastancia del sistema respiratorio). La exposición a LPS causó un aumento de los neutrófilos en la BALF, mientras que ninguna de las otras exposiciones afectó la composición de las células en BALF. La exposición a LPS, Poly (I: C), Imiquimod y P/I causó una marcada infiltración de células inflamatorias y un aumento de los mastocitos alrededor de las vías respiratorias pequeñas. Para la expresión de mediadores inflamatorios, LPS aumentó CXCL8, poli (i: c) e imiquimod disminuyeron IL-4 e IL-5, y aumentó IFNγ. Imiquimod aumentó CXCL8 e IL-6, mientras que P/I disminuyó IL-5 y aumentó IL-6 e IFNγ. Los aumentos en RRS, ERS y la inflamación de las vías respiratorias, pero no la expresión alterada de las citocinas inflamatorias, fueron atenuadas por dexametasona.
Conclusiones
Los agonistas de TLR promueven la inflamación aguda de las vías respiratorias e inducen la obstrucción de las vías respiratorias e hiperreactividad en conejillos de indias. La gravedad de estos efectos varía según los agonistas específicos utilizados. En particular, la dexametasona invirtió los cambios funcionales pulmonares y la inflamación bronquial mitigada causada por el tratamiento combinado de P/I. Sin embargo, no tuvo impacto en la expresión de mediadores inflamatorios.
Fondo
El asma es una enfermedad heterogénea caracterizada por la obstrucción del flujo de aire, la inflamación de las vías respiratorias, la hiperreactividad de las vías respiratorias y la remodelación de las vías respiratorias. Los síntomas más comunes son la tos, el sibilancias, la opresión del pecho y la falta de aliento. Hoy, el asma afecta a aproximadamente 300 millones de personas en todo el mundo, lo que resulta en una importante carga mundial de atención médica (1, 2). Una causa importante de la obstrucción de las vías respiratorias en el asma alérgico es la exposición a los alérgenos, donde los mastocitos se activan y se degranulan, liberando mediadores contráctiles y proinflamatorios como histamina, proteasas, leucotrienas, citocinas y quimiocinas, que conducen a la inflamación y los musculares suaves y los musculares suaves constricción (3). Afortunadamente, con el manejo general del asma general, incluidos los corticosteroides inhalados y los agonistas β2, muchos pacientes están bien controlados (4). Sin embargo, cuando los pacientes asmáticos sufren de infecciones respiratorias, pueden experimentar exacerbaciones de sus síntomas, lo que requiere atención médica inmediata. La causa más común de las exacerbaciones del asma son las infecciones respiratorias virales (5), sin embargo, los mecanismos por los cuales estas infecciones conducen a la obstrucción de las vías respiratorias siguen sin estar claros.
Las infecciones virales respiratorias más frecuentes que desencadenan exacerbaciones asmáticas son el rinovirus (RV) y el virus sincitial respiratorio (RSV) (6). Cuando los microorganismos entran en el cuerpo, son reconocidos por los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) y activan el sistema inmune innato como la primera línea de defensa. Hay varios tipos de PRR, de los cuales los receptores tipo Toll (TLR) son una familia. Hay 10 TLR diferentes en humanos (7, 8). Estudios anteriores han demostrado que cuando el epitelio infectado de RV, RSV y SARS-CoV-2, sus genomas de ARN monocatenario (SSRNA) pueden detectarse directamente por TLR7 en endosomas (9, 10). Además, los virus pueden replicarse en las células epiteliales de las vías respiratorias, produciendo ARN doble cadena (dsRNA) que es reconocido por los receptores TLR3 presentes en células epiteliales o células dendríticas (11). Además, las infecciones bacterianas gramnegativas como Moraxella catarrhalis y Haemophilus influenzae explican una gran proporción de infecciones clínicas del tracto respiratorio clínico temprano en niños y pueden causar exacerbaciones. LPS, un componente principal de la membrana externa de las bacterias gramnegativas, es reconocido por TLR4 presente en las células epiteliales de las vías respiratorias (12). Aunque se ha demostrado que la activación de TLR3 y TLR4 puede causar un aumento de los receptores contráctiles en el músculo liso de las vías respiratorias, los TLR no causan contracciones directas (13). En cambio, es posible que la activación inflamatoria cause una liberación de sustancias contráctiles que inducen la obstrucción de las vías respiratorias.
Para investigar cómo la infección bacteriana y viral causa el estrechamiento y la exacerbación de las vías respiratorias, se necesita un modelo relevante para la contracción de las vías respiratorias pequeñas y los mastocitos. Se seleccionaron conejillos de indias para este estudio porque, en comparación con el modelo de ratón, la respuesta de sus vías respiratorias a la estimulación alergénica aguda es casi idéntica a la de los humanos, y el control neuronal de su vía aérea es muy similar al de los humanos (14, 15). Por el contrario, los modelos de ratones tienen varias limitaciones al estudiar la exacerbación del asma, ya que son diferentes de los humanos con respecto a la farmacología de su músculo liso, y tienen un número limitado de mastocitos en el pulmón (16). Para investigar el efecto de las infecciones microbianas en conejillos de indias, se administraron agonistas de TLR para imitar las infecciones de las vías respiratorias. Además, para investigar los efectos agudos del tratamiento con corticoides en la estimulación específica de la viral, se administró dexametasona cuando los agonistas TLR3 y TLR7 se administraron conjuntamente.
Métodos
Animales
Se obtuvieron conejillos de indias de Dunkin-Hartley que pesaban entre 300 y 400 g de Envigo (Horst, Países Bajos) y se alojaron en Astrid Fagræus Laboratory (Solna, Suecia) en un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h con alimentos y agua proporcionados con Libitum . La elección del sexo se hizo para prevenir conflictos físicos en las jaulas. Todos los experimentos se iniciaron al menos una semana después de que los animales se aclimataron y fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación Animal de Estocolmo (número de permiso: 10973 – 2019 y 21900 – 2022).
Protocolo de desafío
Después de una breve anestesia con isoflurano al 5%, los conejillos de indias fueron desafiados intranasalmente todos los días durante cuatro días consecutivos con PBS, 0.25 µg/g de LPS (L4391, Sigma-Aldrich, Burlington, Estados Unidos), 2.5 µg/g de poli (I: C: C: C ) (P9582, Sigma-Aldrich), vehículo (PBS que contiene 25% de DMSO), 0.3 µg/g imiquimod (i5159, Sigma-Aldrich) o el uso combinado de poli (i: c) e imiquimod (P/I). Además, los animales que recibieron P/I también fueron tratados con 20 mg/kg de dexametasona (011021, Abboxia, Mölndal, Suecia) (17, 18), un día antes del inicio del experimento y luego una hora antes de cada desafío por inyección intraperitoneal.
Mediciones no invasivas de respuestas respiratorias
Después de cada desafío, los patrones respiratorios de los conejillos de indias fueron registrados por un pletismografía de todo el cuerpo (EMMS, Hampshire, Reino Unido) durante una hora. Cada conejillo de indias se colocó en una cámara ventilada. Los sensores en la parte superior de la cámara detectaron cambios en el patrón de respiración. Pausa mejorada (PENH) fue adquirida por el software EDACQ versión 1.8 (EMMS).
Mediciones invasivas de la mecánica pulmonar
Un día después del último desafío, los conejillos de indias se anestesiaron con clorhidrato de ketamina de 40 mg/kg (MSD Animal Health, Suecia) y 0,75 mg/kg de clorhidrato de medetomidina (Vetmedic, Suecia). Los animales fueron traqueestomizados, intubados y ventilados utilizando el sistema flexible (scireq) con el módulo FX4. Fueron expuestos a aerosoles PBS durante 10 s, seguidos de mediciones basales de mecánica respiratoria, incluidas las RR y los ER, utilizando un modelo de compasión única. El aumento de las concentraciones de metacolina (A2251, Sigma-Aldrich) a 0.03125, 0.0625, 0.094, 0.125, 0.19 y 0.25 mg/ml se administraron mediante nebulización a intervalos de 7 minutos. Los niveles de saturación de oxígeno en la sangre (SPO₂) y la frecuencia cardíaca de los conejillos de indias se monitorearon continuamente durante todo el procedimiento. El experimento se terminó cuando estas mediciones se volvieron indetectables.
Análisis de células de fluido de lavado broncoalveolar (BALF)
Los animales se sometieron a lavado con 5 ml de PBS estéril dos veces. El fluido obtenido se centrifugó y las células BALF se resuspendieron para contar. Luego, se cargaron 50,000 células en 100 µl de PBS en portaobjetos de citospina y se tiñeron con mayo Grünwald – Giemsa. Los recuentos de células diferenciales se realizaron en 300 células seleccionadas al azar usando un microscopio.
Histología del tejido pulmonar
Después del experimento in vivo, el lóbulo pulmonar caudal derecho se dividió en dos partes iguales. Un segmento se sometió a una fijación en la solución de Carnoy (etanol al 60%, 30% de cloroformo y ácido acético al 10%), seguido de tinción de astras de hematoxilina Astra para la cuantificación de las células de los mastocitos. Simultáneamente, el otro segmento se fijó en el formaldehído tamponado al 4% para la tinción de hematoxilina-eosina (H&E) para analizar la inflamación de las vías respiratorias. Las imágenes de los portaobjetos teñidos se tomaron a × 20 aumento utilizando un escáner de portaobjetos Zeiss Axioscan.z1 (Zeiss, Oberkochen, Alemania). La cuantificación de los mastocitos se realizó a través del recuento manual. El software Zen (versión 3.3, versión azul, Zeiss) se empleó para calcular el área de infiltración inflamatoria y el diámetro bronquial. Las cuantificaciones se realizaron analizando todas las vías respiratorias pequeñas presentes en todas las imágenes pulmonares de manera cegada, y los resultados se normalizaron al diámetro de la vía aérea.
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