IL-37 protege contra la remodelación de las vías respiratorias al revertir la transición epitelial-mesenquimatosa bronquial a través de la vía de señalización de IL-24 en el asma crónica

Resumen

Fondo

La transición epitelial-mesenquimatosa (EMT) es uno de los mecanismos de remodelación de las vías respiratorias en el asma crónica. La interleucina (IL)-24 se ha implicado en la promoción de la fibrosis tisular y se han observado niveles elevados de IL-24 en las secreciones nasales y el esputo de pacientes asmáticos. Sin embargo, el papel de la IL-24 en la remodelación de las vías respiratorias de los asmáticos, especialmente en la EMT, sigue siendo en gran parte desconocido. Nuestro objetivo fue explorar el efecto y el mecanismo de la IL-24 en la EMT y verificar si la IL-37 podría aliviar la EMT inducida por IL-24 en el asma crónica.

Métodos

Se expusieron células BEAS-2B a IL-24 y se evaluó la migración celular mediante ensayos de curación de heridas y Transwell. La expresión de biomarcadores relacionados con EMT (E-cadherina, vimentina y α-SMA) se evaluó después de estimular las células con IL-24 con o sin IL-37. Se estableció un modelo de asma murino mediante la administración intranasal de extractos de ácaros del polvo doméstico (HDM) durante 5 semanas, y se investigaron los efectos de IL-24 e IL-37 en la EMT y la remodelación de las vías respiratorias mediante la administración intranasal de si-IL-24 y rhIL -37.

Resultados

Observamos que IL-24 mejoró significativamente la migración de células BEAS-2B in vitro. IL-24 promovió la expresión de los biomarcadores EMT vimentina y α-SMA a través de las vías STAT3 y ERK1/2. Además, encontramos que IL-37 revirtió parcialmente la EMT inducida por IL-24 en células BEAS-2B al bloquear las vías ERK1/2 y STAT3. De manera similar, los resultados in vivo mostraron que la IL-24 se sobreexpresó en el epitelio de las vías respiratorias de un modelo de asma crónica inducida por HDM, y el silenciamiento de IL-24 o el tratamiento con IL-37 podría revertir la expresión del biomarcador EMT.

Conclusiones

En general, estos hallazgos indicaron que la IL-37 mitigó la remodelación de las vías respiratorias inducida por HDM al inhibir la EMT mediada por IL-24 a través de las vías ERK1/2 y STAT3, lo que proporcionó evidencia experimental de la IL-24 como un nuevo objetivo terapéutico y de la IL-37 como un agente prometedor para el tratamiento del asma grave.

Fondo

El asma es una enfermedad crónica heterogénea con características patológicas de obstrucción variable del flujo de aire, hiperreactividad de las vías respiratorias, inflamación y remodelación de las vías respiratorias. [1]. La inflamación crónica de las vías respiratorias y la reparación tisular repetida en respuesta al estrés ambiental externo persistente pueden inducir una remodelación estructural irreversible de las vías respiratorias en el asma [2, 3]. En particular, las características de la remodelación de las vías respiratorias incluyen disfunción de la barrera epitelial, metaplasia de células caliciformes, engrosamiento de la capa de músculo liso de las vías respiratorias y angiogénesis, que contribuyen al asma resistente a los esteroides, así como a la exacerbación aguda del asma. [4,5,6]. Por lo tanto, la identificación de intervenciones eficaces para la aparición y el desarrollo tempranos de la remodelación de las vías respiratorias es beneficiosa para mejorar el pronóstico de los pacientes asmáticos.

La transición epitelial-mesenquimatosa (EMT) es un proceso fisiopatológico en el que las células epiteliales se transforman en células mesenquimatosas diferenciadas a través de la transformación fenotípica y se caracteriza por varios cambios, incluida la pérdida de la polaridad de las células epiteliales y el marcador epitelial E-cadherina, junto con la adquisición de capacidad de migración y regulación positiva de los marcadores mesenquimales vimentina, α-SMA, N-cadherina y fibronectina [7, 8]. La EMT disfuncional se considera una de las principales causas de la generación de células mesenquimales, la fibrosis de los órganos, la reparación del tejido fibrótico y la metástasis del cáncer. [9,10,11]. La evidencia emergente ha demostrado que la transformación de las células epiteliales en miofibroblastos es el mecanismo clave que contribuye a la remodelación de las vías respiratorias en el asma refractaria grave [5, 12]pero los factores intrínsecos asociados con la EMT no se han determinado por completo.

IL-24, que también se conoce como gen 7 asociado a la diferenciación de melanoma (MDA-7), es un miembro de la familia de citoquinas IL-10 [13]. Como citocina pleiotrópica, su actividad depende principalmente de los patrones de expresión de los receptores heterodiméricos (IL-20RA/IL-20RB e IL-22RA/IL-20RB) en los tejidos diana para mediar en las vías de señalización posteriores. [14]. Recientemente, una serie de estudios han informado la conexión entre la IL-24 y las enfermedades inmunoinflamatorias, incluido el asma. [15]soriasis [16]lupus eritematoso sistémico [17]dermatitis atópica [18]Enfermedad inflamatoria intestinal [19, 20]y artritis reumatoide [21]. A pesar de su amplio efecto antitumoral [22], varias líneas de evidencia han revelado que la IL-24 también muestra un efecto profibrótico en la remodelación de tejidos. Por ejemplo, Pap et al. demostraron que la expresión de α‑SMA, fibronectina y TGF-β era menor en los riñones de los ratones IL-20RB KO que en los de los ratones WT [23]. Asimismo, disminución de la expresión de fibronectina y colágeno I en IL-24(-/-) Se observaron ratones inducidos por bleomicina en comparación con ratones WT. [24]. Además, un estudio de Novak et al. mostró que las tres subunidades receptoras de IL-24 (IL-20R1, IL-20R2 e IL-22R1) podían detectarse en células epiteliales de pulmón humano [14, 25]. Es importante destacar que la IL-24 se sobreexpresó en las secreciones nasales y el esputo inducido de pacientes asmáticos. [15]. Sin embargo, poca evidencia ha demostrado la interacción entre la IL-24 y la remodelación de las vías respiratorias relacionada con la EMT en el asma, y ​​el mecanismo potencial aún no está claro.

IL-37, que es uno de los miembros de la familia IL-1, tiene fuertes efectos antiinflamatorios en la inmunidad innata y adaptativa [26]. Nuestro trabajo anterior demostró que la IL-37 aliviaba la infiltración de eosinófilos en las vías respiratorias y la remodelación de las vías respiratorias en un modelo de asma murina inducida por HDM [27]. Aún no está claro si el regulador negativo IL-37 podría ejercer un efecto terapéutico sobre la EMT mediada por IL-24 en el epitelio bronquial, para regular la remodelación de las vías respiratorias en el asma.

En el estudio actual, para determinar mejor la función biológica de la IL-24 en el asma, examinamos el papel y el mecanismo de señalización de la IL-24 en las células BEAS-2B, centrándonos en la migración y la EMT, y luego aclaramos si la IL-37 podría inhibir la remodelación de las vías respiratorias asmáticas inducida por HDM al afectar la EMT inducida por IL-24.

Métodos

Cultivo de células

Se adquirió una línea de células epiteliales bronquiales humanas normales (BEAS-2B) de American Type Culture Collection (ATCC, EE. UU.). Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 completo (Gibco, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS, Gibco) y estreptomicina/penicilina al 1 % (Gibco) en una incubadora humidificada que contenía un 5 % de CO2 atmósfera a 37 °C. La inhibición de la vía de señalización JAK/STAT3 y ERK1/2 se hizo referencia a métodos anteriores [28, 29]. En resumen, las células se pretrataron con tofacitinib (50 μM, un inhibidor de JAK, MCE), PD98059 (20 μM, un inhibidor de ERK1/2, MCE) o DMSO (proporción de dilución igual a los inhibidores específicos) durante 1 h, y luego se expusieron a rhIL-24 (100 ng/ml) durante 24 h o 48 h. Todos los experimentos con células se repitieron de forma independiente tres veces.

Ensayo de viabilidad celular

Determinar el efecto citotóxico de IL-24 en células BEAS-2Bs, se realizó un ensayo Cell Counting Kit-8 (Beyotime, Shanghai, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se sembraron en una placa de 96 pozos (1 × 104/pozo) y tratado con varias concentraciones de IL-24 (0,1–100 ng/ml, cat# 200-35-20, PeproTech, EE. UU.) a 37 °C. Después de la incubación durante 24 h, se agregaron 10 μl de solución CCK-8 (Beyotime) a cada pocillo y luego las células se incubaron durante 2 h a 37 °C. Finalmente, se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas (BioTek, EE. UU.). Establecimos cinco pozos replicados por grupo, y cada experimento se repitió tres veces.

Ensayo de apoptosis celular

Para el análisis de apoptosis, las células (5 × 105/pocillo) se sembraron en una placa de 6 pocillos y se trataron con 10 o 100 ng/ml de IL-24 durante 24 h. Las suspensiones unicelulares se recogieron y se incubaron con 3 μl de anexina V-FITC y anticuerpos de yoduro de propidio (PI) (Beyotime) durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad para el análisis de apoptosis utilizando un citómetro de flujo (BD Biosciences, EE. UU.) según los procedimientos del kit. Los datos representan tres experimentos independientes.

Análisis del ciclo celular

Para el análisis del ciclo celular, las células…

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