Resumen
Antecedentes
El adenocarcinoma de pulmón (LUAD) es un subtipo prevalente de cáncer de pulmón (LC) cuya progresión está regulada por múltiples genes. Este estudio buscó encontrar el impacto y el mecanismo de HNRNPH1 en Luad.
Métodos
Se detectó la expresión y el papel de HSP90AB1, HNRNPH1 y la proteína relacionada con la autofagia MAP1LC3B en LUAD. Además, el análisis bioinformático, las técnicas de silenciamiento y sobreexpresión, y el modelado in vivo se utilizaron para explorar los mecanismos reguladores de estas proteínas en la progresión de LUAD.
Resultados
HSP90AB1 mostró una alta expresión en Luad y estaba vinculada a un peor pronóstico. La sobreexpresión de HSP90AB1 promovió significativamente el fenotipo maligno de las células LUAD e inhibió la autofagia mediada por MAP1LC3B. Sin embargo, la sobreexpresión de HNRNPH1 podría revertir el fenotipo maligno resultante de la sobreexpresión de HSP90AB1 y promover la autofagia mediada por MAP1LC3B al unirse al ARNm de HSP90AB1 e inhibir su expresión de proteínas. Los experimentos con animales también revelaron que la sobreexpresión de HNRNPH1 podría inhibir la progresión tumoral al promover la autofagia celular.
Conclusiones
Verificamos el papel clave de HSP90AB1, HNRNPH1 y MAP1LC3B en LUAD, y revelamos un posible mecanismo regulatorio, a saber, HNRNPH1 podría inhibir el desarrollo de LUAD al promover la autofagia a través del eje HSP90AB1/MAP1LC3B. Estos hallazgos pueden ofrecer nuevas ideas para mejorar el tratamiento y el pronóstico de LUAD.
Número de ensayo clínico
No aplicable.
Introducción
El adenocarcinoma de pulmón (LUAD) comprende aproximadamente el 40% de todos los casos de cáncer de pulmón (LC) (1). A pesar de los avances en la comprensión de la patogénesis y el desarrollo de nuevos tratamientos, Luad desafortunadamente sigue siendo uno de los tipos de tumores más agresivos. Luad se diagnostica típicamente en una etapa tardía, lo que resulta en una supervivencia general (SG) de menos de cinco años. La alta resistencia de Luad a la quimioterapia plantea un desafío significativo para la eficacia del tratamiento (2). Por lo tanto, es crítico y urgente explorar nuevos biomarcadores para el tratamiento de pacientes con LUAD para mejorar los resultados de supervivencia.
Una de las proteínas de choque térmico más abundante (HSP), HSP90, puede mantener la homeostasis y prevenir el daño celular inducido por el estrés. El nivel de expresión de HSP90 en condiciones normales es de aproximadamente 1–2% de la proteína total, mientras que en las células cancerosas su expresión aumenta de 2 a 10 veces (3). La regulación positiva de HSP90 está vinculada a la formación de tumores, la invasión y la metástasis, junto con la resistencia a los medicamentos (4). Como resultado, la inhibición de HSP90 se ha convertido en una estrategia prometedora de tratamiento tumoral. Los estudios han demostrado que HSP90-β (HSP90AB1) se sobreexpresa en cáncer de mama, cáncer de glándula salival, LC y otros tejidos de cáncer (5,6,7). Estudios recientes encuentran que la expresión de HSP90AB1 está regulada en el derribo pleural maligno y suero de pacientes con LC, y existe una correlación potencial entre HSP90AB1 y el grado patológico y la etapa clínica de LC ((8,9,10). En general, HSP90AB1 promete ser un biomarcador novedoso para el diagnóstico y la terapia dirigida de LUAD.
La autofagia es una vía clave de homeostasis que promueve la degradación y el reciclaje de materiales celulares. La autofagia tiene un doble papel en el cáncer que parece depender de la etapa tumoral, la mutación específica que causa el cáncer y el entorno celular (11). Se han propuesto intervenciones dirigidas a la autofagia como tratamientos contra el cáncer (12). La evidencia sugiere que los genes relacionados con la autofagia regulan la infiltración de células inmunes y están relacionados con el pronóstico de Luad (13). La cadena ligera de proteína asociada a microtúbulos 3 (LC3) y P62 se utilizan comúnmente como indicadores para evaluar los niveles de autofagia (14). La acumulación de p62 está vinculada al mal pronóstico en pacientes con LUAD (15). MAP1LC3A/LC3A está inversamente relacionado con la metástasis de grado histológico y distante de LC (16). La predicción de Biogrid ha demostrado la unión de la proteína HSP90AB1 y la proteína MAP1LC3B. Sin embargo, el papel de la proteína MAP1LC3B en LUAD y su interacción con la proteína HSP90AB1 aún debe explorarse más a fondo.
Las ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (HNRNP) representan una gran clase de proteínas de unión a ARN (RBP) que están involucradas en múltiples aspectos del metabolismo del ácido nucleico y juegan roles importantes en la salud y la enfermedad ((17). En el linfoma difuso de células B grandes, los pacientes con alta expresión de HNNPH1 mostraron un pronóstico más favorable. Además, hubo una correlación entre la cantidad de diferentes células inmunes y la expresión de HNRNPH1 (18). Además, la cizalla y la mutación hnRnph1 están relacionadas con un mal pronóstico en pacientes con linfoma de células de manto, manifestados por SG más corta y supervivencia libre de enfermedad (DFS) (19). El nivel de expresión de HNRNPH1 en los tejidos colorrectales normales es alto, mientras que en los tejidos de cáncer colorrectal varía de bajo a alto (20). En LC, HNRNPH1 se identificó como un gen piloto de apoptosis (21). La predicción de RBP-MRNA basada en StarBase ha revelado la unión del ARNm de HNRNPH1 y HSP90AB1. Sin embargo, no se ha informado el efecto de la interacción entre el ARNm de HNRNPH1 y HSP90AB1 en LUAD.
Con base en la investigación anterior, este estudio verificó a través del análisis bioinformático, combinado con experimentos celulares y animales, que HNRNPH1 promovió la autofagia para inhibir la progresión de LUAD regulando el eje HSP90AB1/MAP1LC3B. Este trabajo enriquecerá nuevas ideas sobre el diagnóstico y los biomarcadores pronósticos de Luad, así como el desarrollo de nuevos métodos de tratamiento.
Materiales y métodos
Cultivo celular y tratamiento
Los fibroblastos pulmonares fetales humanos (HFL-1, AW-CNH092, Abiowell, China) y las células A549 (AW-CCH011, Abiowell, China) se cultivaron en medio F12K (AW-MC004, Abiowell, China). Las células CALU-3 (AW-CCH090, Abiowell, China) se cultivaron en MEM (AW-MC003, Abiowell, China). Las células HCC827 (AW-CCH208, Abiowell, China) y las células NCI-H358 (AW-CCH297, Abiowell, China) se cultivaron en medio RPMI-1640 (AW-MC002, Abiowell, China). Se agregaron suero bovino fetal al 10% (FBS, 10099141, Gibco, EE. UU.) Y al 1% de penicilina/estreptomicina (AWH0529A, Abiowell, China) a los medios culturales anteriores. Las células anteriores se cultivaron en una incubadora de humedad saturada a 37 ℃ con 5% de CO2. Todas las líneas celulares se verificaron mediante repetición en tándem corta (STR). Cuando la confluencia celular alcanza el 70-80%, se puede usar para el paso, la transfección y otros experimentos. Los plásmidos o siRNA (HonorGene, China) se transfectaron usando Lipofectamine 2000 (11668019, Invitrogen, EE. UU.). En el proceso de investigación de la autofagia, las células se trataron con inhibidor de autofagia 2.5 mM, 3-metiladenina (3-Ma, M9281, Sigma), durante 3 h y luego se transfectaron con los ARNA correspondientes (22).
Análisis bioinformático
Los datos relacionados con el adenocarcinoma de pulmón y la información clínica correspondiente se descargaron y recopilaron del Atlas del genoma del cáncer (TCGA; https://xenabrowser.net/). Se recopilaron datos de muestra normales del proyecto de expresión de tejido genotipo (GTEX; https://www.gtexportal.org). Los valores de fragmentos por kilobase (FPKM) se convirtieron en transcripciones por kilobase (TPM). La prueba de Wilcoxon se usó para comparar la expresión de HSP90AB1 y HNRNPH1 en tejidos normales y tumorales. El corte para los grupos de alta y baja expresión de HSP90AB1 se estableció en Logfc> LOG2 (1.0) y Valor P <0.05. El paquete R "Surverminer" se utilizó para estimar la supervivencia general (OS) entre los grupos de expresión alta y baja de HSP90AB1 utilizando gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier. La regresión de Cox para el análisis de supervivencia se realizó utilizando el paquete R "Supervivencia". Las curvas de operación del receptor dependiente del tiempo (ROC) se trazaron utilizando el paquete R "Timeroc".
Todos los conjuntos de genes de Gene Ontology (GO, https://ftp.ncbi.nih.gov/gene/data/gene2go.gz) y la enciclopedia de Kioto de genes y genomas (Kegg, http://www.genome.jp/kegg/) se descargaron de la base de datos MSIGDB. El análisis de variación del conjunto de genes (GSVA) se realizó utilizando el paquete GSVA R.
Construcción del modelo de tumor de xenoinjerto
Se compraron ratones desnudos masculinos de Balb/c (4 semanas) en Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, China). Fueron alojados en jaulas específicas sin patógenos (SPF). Las condiciones incluyeron una temperatura de 25 ± 2 ℃, humedad de 50 ± 5%y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, con libre acceso a alimentos y agua. Después de un período de aclimatación de una semana, comenzaron los experimentos.
Los ratones desnudos se dividieron aleatoriamente en grupos OE-NC, OE-HNRNPH1, 3-MA y OE-HNRNPH1 + 3-MA, con 3 ratones en cada grupo. 2 × 106 A549 células transfectadas con el plásmido OE-NC o OE-HNRNPH1 se inyectaron subcutáneamente en el lado dorsal de ratones desnudos. Para inhibir la autofagia, los ratones desnudos recibieron inyección intraperitoneal de 3-Ma (10 mg/kg) una vez al día durante 14 días el séptimo día después de la implantación tumoral (23). La longitud del tumor (L) y el ancho (W) se midieron dos veces por semana en cada grupo. El volumen del tumor se calculó utilizando la siguiente fórmula: V = 1/2 × L × W2 (24). El día 21 después de la implantación tumoral, todos los ratones desnudos fueron sacrificados por inyección intraperitoneal de 150 mg/kg de pentobarbital de sodio (25). Los tejidos tumorales se aislaron, pesaron y pretrataron para su posterior estudio.
Análisis estadístico
Todos los datos experimentales se analizaron utilizando GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software Inc., EE. UU.) Y se presentó como media ± desviación estándar (DE) de tres experimentos independientes. Los datos cumplieron con los supuestos de distribución normal y homogeneidad de varianza, que se verificaron a través de la prueba de Kolmogorov-Smirnov y la prueba de estadísticas descriptivas exploratorias. Para las comparaciones entre múltiples grupos, se realizó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba post-hoc de Tukey. La significación estadística se definió como p <0.05.
Las descripciones detalladas de otros materiales y métodos utilizados en este trabajo se proporcionan en los materiales y la tabla complementarios. S1–2.
Resultados
HSP90AB1 se expresó altamente en Luad e indicó un mal pronóstico
La base de datos TCGA-LUAD mostró una regulación positiva de la expresión del gen HSP90AB1 en pacientes con LUAD (Fig. 1A). Los paquetes de software R «Survminer» y la trama de supervivencia de Kaplan-Meier …
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