GDF15 mejora la lesión pulmonar inducida por sepsis a través de la inhibición de la glucólisis mediada por AMPK en los macrófagos alveolares

Resumen

El factor de diferenciación de crecimiento 15 (GDF15) como citoquina de respuesta al estrés está involucrado en el desarrollo y progresión de varias enfermedades asociadas con trastornos metabólicos. Sin embargo, el papel regulador y los mecanismos subyacentes de GDF15 en la sepsis siguen estando mal definidos. Nuestro estudio analizó los niveles de GDF15 y sus correlaciones con el pronóstico clínico de pacientes con sepsis. Se aplicaron modelos de sepsis in vivo e in vitro para dilucidar el papel y los mecanismos de GDF15 en la lesión pulmonar asociada a la sepsis. Observamos fuertes correlaciones de los niveles plasmáticos de GDF15 con los niveles de proteína C reactiva (PCR), procalcitonina (PCT), lactato deshidrogenasa (LDH) y lactato, así como con las puntuaciones de la Evaluación de insuficiencia orgánica secuencial (SOFA) en pacientes con sepsis. En el modelo murino de sepsis inducida por lipopolisacáridos, el GDF15 recombinante inhibió las respuestas proinflamatorias y alivió la lesión del tejido pulmonar. Además, GDF15 disminuyó los niveles de citocinas producidas por los macrófagos alveolares (AM). El efecto antiinflamatorio del inhibidor de la glucólisis 2-DG en los AM durante la sepsis estuvo mediado por GDF15 mediante la inducción de la fosforilación de la subunidad α del factor de iniciación eucariota 2 (eIF2α) y la expresión del factor de transcripción activador 4 (ATF4). Además, exploramos el mecanismo subyacente a los efectos beneficiosos de GDF15 y descubrimos que GDF15 inhibía la glucólisis y la señalización de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK)/factor nuclear-κB (NF-κB) mediante la promoción de la fosforilación de AMPK. Este estudio demostró que GDF15 inhibía la glucólisis y la señalización de NF-κB/MAPK mediante la activación de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK), aliviando así las respuestas inflamatorias de los AM y la lesión pulmonar asociada a la sepsis. Nuestros hallazgos proporcionaron nuevos conocimientos sobre nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de la sepsis.

Introducción

La sepsis es una disfunción orgánica potencialmente mortal causada por la respuesta desadaptada del huésped a la infección.1). La lesión pulmonar es la complicación más común de la sepsis, que conduce a la hipoxia causada por el trastorno del intercambio de gases y sangre, agravando la lesión de otros órganos. A pesar de los avances en las estrategias de ventilación, la mortalidad por lesión pulmonar inducida por sepsis sigue siendo alta (2). La respuesta inmunitaria desregulada es el sello distintivo de la lesión pulmonar inducida por sepsis. Los macrófagos alveolares (MA), como principales células inmunitarias innatas, son responsables del inicio y la resolución de las respuestas inmunitarias pulmonares (3). Al inicio de la sepsis, los MA se activan y secretan una gran cantidad de factores inflamatorios, como el factor de necrosis tumoral α (TNFα), la interleucina-1β (IL-1β) y la interleucina-6 (IL-6), desencadenando la inflamación. tormenta de citocinas y daño tisular. Por lo tanto, interferir en la abrumadora respuesta inflamatoria de los AM se considera una estrategia terapéutica importante para tratar la lesión pulmonar relacionada con la sepsis.

El factor de diferenciación del crecimiento 15 (GDF15), también denominado citocina inhibidora de macrófagos 1 (MIC1), es un miembro divergente de la superfamilia del factor de crecimiento transformante β (TGFβ) (4). Como citocina circulante, GDF15 ha estado implicada en múltiples procesos biológicos asociados con la homeostasis energética (5). GDF15 es un factor de respuesta al estrés que está involucrado en varias enfermedades pulmonares, incluido el cáncer de pulmón, la fibrosis pulmonar y la hipertensión arterial pulmonar (6,7,8). Más recientemente, se ha reconocido que GDF15 es una hormona relacionada con la inflamación que es esencial para sobrevivir a las infecciones (9, 10). Al regular el metabolismo de los triglicéridos, GDF15 coordina la tolerancia del huésped a los estímulos inflamatorios (11). La deficiencia de GDF15 agravó la lesión renal y cardíaca en la sepsis debido al aumento de citocinas inflamatorias. Según lo anterior, GDF15 puede estar involucrado en la respuesta inflamatoria durante la lesión pulmonar inducida por sepsis. Sin embargo, el efecto regulador detallado y los mecanismos subyacentes de GDF15 sobre los AM en la lesión pulmonar inducida por sepsis siguen sin ser exclusivos.

Estudios recientes sobre el inmunometabolismo han informado que las funciones de los macrófagos están estrechamente relacionadas con la glucólisis aeróbica (12). La inhibición de la glucólisis alivia la inflamación y el daño orgánico inducidos por la sepsis (13, 14). Se sabe que el GDF15 desempeña un papel fundamental en el metabolismo energético (15, dieciséis). Metformina, que puede mejorar la glucólisis aeróbica mediada por mTOR/HIF1⍺ (17), se ha informado que aumenta los niveles circulantes de GDF15 (18). Sin embargo, aún se desconoce la interacción reguladora entre la glucólisis y el GDF15.

En el presente estudio, encontramos que aunque los niveles plasmáticos de GDF15 se correlacionaron positivamente con la gravedad de los pacientes con sepsis, la administración de GDF15 recombinante in vivo alivió la inflamación sistémica y la lesión pulmonar inducidas por la sepsis. Además, demostramos que la inhibición de la glucólisis indujo la expresión de GDF15 en AM mediante la activación de la señalización de eIF2⍺-ATF4. Además, GDF15 alivió la respuesta inflamatoria de los AM en la lesión pulmonar inducida por sepsis mediante la inhibición de la glucólisis mediada por la activación de AMPK y la señalización de MAPK/NF-κB. Nuestros hallazgos revelan el papel beneficioso de GDF15 en la inflamación de la mañana durante la sepsis, proporcionando una posible estrategia terapéutica para tratar la lesión pulmonar relacionada con la sepsis.

Materiales y métodos

Protocolo de estudio del paciente

Se inscribieron pacientes diagnosticados con sepsis en el Departamento de Medicina de Cuidados Intensivos del Hospital Ruijin de Shanghái desde el 1 de julio de 2021 hasta el 31 de mayo de 2022. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del hospital Ruijin (20,200,011). La investigación se basó en las pautas de la institución para estudios en humanos y se ajustó a las pautas éticas de la declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado de cada participante. Los criterios de inscripción fueron los siguientes: (1) 18-80 años; (2) adherencia a los criterios de diagnóstico de sepsis 3.0; (3) estancia hospitalaria > 24 h. Los criterios de exclusión correspondientes fueron los siguientes: (1) alta o muerte dentro de las 24 h posteriores al ingreso; (2) participación en otra investigación clínica; (3) cirugía de emergencia después del ingreso; y (4) tumor maligno; (5) pacientes embarazadas; (6) falta de datos clínicos necesarios. Finalmente, se inscribieron un total de 12 voluntarios sanos, 29 pacientes sépticos.

Reactivos

2-DG (#S4701), ISRIB (#S0706), Salubrinal (#S2923), GCN2IB (#S8929), C16(#S9668), GSK2656157 (#S7033) y Compuesto C (#S7840) se adquirieron en Selleck (Shanghai, China). El lipopolisacárido (LPS, #L2630, E. coli 0111:B4) se adquirió en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El GDF15 recombinante de ratón (#10596-GD-025) se adquirió en R&D Systems (Minnesota, EE. UU.). ARNi ATF4 de ratón agrupado (n.º 1. Sentido-5'-CUCCCAGAAAGUUUAAUAATT-3', antisentido-5'- UUAUUAAACUUUCUGGGAGTT-3'; n.º 2. Sentido-5'-GCUGCUUACAUUACUCUAATT-3', antisentido-5'-UUAGAGUAAUGUAAGCAGCTT-3'; n.º 5'-GUCUCUUAGAUGACUAUCUTT-3', antisentido-5'-AGAUAGUCAUCUAAGAGACTT-3') y ARNi GDF15 de ratón agrupado (n.º 1. Sentido-5'-CUCGAACUCAGAACCAAGUTT-3', antisentido-5'-ACUUGGUUCUGAGUUCGAGTT-3'; n.º 2. Sentido-5'-GUGGUUCUUAUGCACAGGATT-3',anti-sentido-5'-UCCUGUGCAUAAGAACCACTT-3'; #3. Sentido-5'-CUGCUAAUAAAGGUGAGCUTT-3', anti-sentido-5'-AGCUCACCUUUAUUAGCAGTT-3') fueron sintetizados por GenePharma (Shanghai, China). Los anticuerpos contra eIF2α fosforilado (3597 S), eIF2α total (5324 S), ATF4 (11,815 S), AMPK fosforilado (2535 S) y AMPK (2532 S) fueron adquiridos de cell signaling technology (MA, EE. UU.). Los anticuerpos contra Glut1 (66 290), HK2 (66 974), PFKFB3 (13 123) y PKM2 (60 268) se obtuvieron de Proteintech (Wuhan, China). El anticuerpo contra GDF15 (ab105738) se adquirió de Abcam (MA, EE. UU.).

Cultivo de células

La línea celular de macrófagos alveolares MH-S (#ZQ0921, ScienCell, CA, EE. UU.) se cultivó en medio completo RPMI 1640 suplementado con 10 % de FBS (AU0600), 1 % de penicilina/estreptomicina, 0,05 mM de β-mercaptoetanol (#ZQ-206, ScienCell) a 37 °C con 95 % de humedad y 5 % de CO2. Las MH-S se trataron previamente con los inhibidores indicados seguido de estimulación con 1 µg/mL de LPS durante los períodos de tiempo indicados para imitar la inflamación.

transfección de ARNi

Las células MH-S se sembraron a una densidad del 50 al 70 %. Se utilizó HiPerFect (301,704, Qiagen, Alemania) como reactivo de transfección según las instrucciones del fabricante. Las células se trataron con diferentes estímulos 48 h después de la transfección y se recolectaron para su posterior análisis.

secuenciación de ARN

El ARN total se extrajo de MH-S estimulado con LPS en ausencia y presencia de 2-DG. La concentración y pureza del ARN aislado se midieron utilizando un espectrofotómetro ND-800 (Thermo Fisher Scientific, DE, EE. UU.). Las bibliotecas de ARN se construyeron utilizando un kit de preparación de bibliotecas de ARN Truseq. La secuenciación se llevó a cabo utilizando una configuración PE de 2 × 150 pb. Los datos limpios (lecturas) se mapearon utilizando Hisat2 (versión 2.1.0). Luego, realizamos un análisis de expresión génica utilizando RSEM (versión 1.3.1). El análisis de expresión diferencial entre diferentes grupos se realizó utilizando DESeq2, y luego |FC| >2 y FDR < 0,05 se determinaron como umbrales para genes expresados ​​diferencialmente (DEG). El análisis de ontología génica (GO) se utilizó para determinar los procesos biológicos significativos de un conjunto de genes en particular (q < 0,05). Se utilizó el análisis de la Enciclopedia de Kioto de Genes y Genomas (KEGG) para identificar las vías de señalización más importantes implicadas en los genes regulados por BMS-303,141 (P ajustada < 0,05). Se utilizó el análisis de Venn para calcular la cantidad de genes en diferentes conjuntos de genes.

Modelo murino

Se obtuvieron ratones machos C57BL/6 (6-8 semanas, 20-25 g) de Charles River (Beijing, China) y se dividieron aleatoriamente en grupos experimentales. A los ratones se les inyectó LPS (5 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal para inducir la endotoxemia. En el grupo de intervención, a los ratones se les inyectó GDF15 recombinante de ratón (50 ng/kg de peso corporal), salubrinal (1 mg/kg de peso corporal) o 2-DG (500 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal 1 h antes de la inyección de LPS. A los ratones de control del vehículo se les inyectó por vía intraperitoneal 100 µL de NaCl al 0,9 %. 16 h después de la inyección de LPS…

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