Resumen
Las enfermedades respiratorias crónicas, como el asma y la EPOC, implican interacciones entre múltiples tipos de células residentes e inmunes dentro de las vías respiratorias bronquiales, lo que resulta en cambios estructurales y funcionales. Por lo tanto, la heterogeneidad celular, los arreglos y los vecindarios asociados, así como las interacciones entre células y matrices, representan áreas de estudio intrigantes pero desafiantes. El perfil fenotípico espacial facilita la exploración de estos problemas del microambiente celular y la identificación de interacciones de células dependientes del contexto. Utilizing spatial phenotyping, we interrogated the features and cellular landscape of lungs from non-asthmatics, asthmatics, and COPD in FFPE samples by developing a 10-plex antibody panel for the Akoya PhenoCycler®-Fusion system, focused on immune cells (CD45, CD3, CD4, CD8), proliferative cells (Ki67, PCNA), Angiogénesis (CD34), epitelio (E-cadherina), músculo liso (SMA) y matriz extracelular (colágeno). Realizamos la segmentación celular en imágenes de inmunofluorescencia multiplex e intensidad del marcador cuantificado en cada célula. Los fenotipos se identificaron manualmente después de la normalización, la integración y las células agrupadoras en las muestras. La composición, el perfil celular y la distribución variaron significativamente entre los asmáticos y la EPOC en comparación con los no atmáticos que enfatizan la heterogeneidad de la enfermedad. El análisis espacialmente agnóstico reveló que el grupo de matriz era más abundante en la EPOC en comparación con los no atmáticos y los asmáticos, consistente con un papel mayor para la fibrosis. Sin embargo, los pacientes asmáticos tenían una mayor proporción de grupos no clasificados y CD8 + que destacaban las respuestas inmunes. El análisis de localización conjunta mostró una distribución casi aleatoria en no atmáticos. Pero una fuerte interacción espacial entre las células T y otras células inmunes o matriciales en el asma, y una mayor evitación de las células inmunes y de músculo liso, y de marcadores proliferativos tanto en asmáticos como en la EPOC. El análisis de nicho demostró diferentes interacciones de células de células recurrentes en cohortes asmáticas y de EPOC. En la EPOC, el nicho enriquecido en células de la matriz era más abundante, mientras que en los asmáticos, el nicho enriquecido de células no clasificado era más frecuente en comparación con los no atmáticos. Estos hallazgos proporcionan información sobre la organización espacial diferencial de las células y los tejidos en el asma y la EPOC, con mecanismos inmunes y epiteliales que sugieren inflamación activa y remodelación en el asma, pero los procesos fibróticos en la EPOC, y el papel potencial para los procesos vasculares en ambas condiciones.
Abstracto gráfico
Introducción
El asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) continúan siendo las principales enfermedades pulmonares obstructivas que afectan a millones en todo el mundo (1,2,3,4). Los avances significativos en la investigación de sus fisiopatías subyacentes han llevado a una mayor comprensión de su complejidad, particularmente la importancia de múltiples tipos de células residentes, como el epitelio, el músculo liso, los fibroblastos y los nervios, así como las células inmunes ((2, 3). Además, la heterogeneidad celular y las interacciones celulares de células y la matriz celular se están reconociendo como procesos críticos que impulsan cambios estructurales y funcionales del asma y la EPOC (5,6,7). Aquí, tales cambios implican una mayor contractilidad de las vías respiratorias y, lo que es más importante, remodelando. La remodelación de las vías respiratorias incluye el engrosamiento de la pared de las vías respiratorias que reflejan un aumento en el número de células, los tipos de células alteradas y la fibrosis de las vías respiratorias (3). La exploración de estos temas requiere herramientas científicas avanzadas más allá de las técnicas basadas en células individuales y aisladas. Una de esas herramientas que ha revolucionado la comprensión de múltiples enfermedades es la biología espacial, con una creciente sofisticación y resolución ofrecida por la transcriptómica espacial y las tecnologías de proteómica espacial.
La biología espacial es un campo relativamente nuevo que permite la visualización de las interacciones celulares dentro del contexto del tejido (5, 8, 9). A diferencia de las técnicas tradicionales que examinan las células aisladas, la biología espacial permite el estudio de las células en su entorno nativo, preservando las relaciones e interacciones espaciales entre los diferentes tipos de células. Este enfoque holístico proporciona información invaluable sobre la arquitectura de los tejidos y la dinámica celular dentro del microambiente de tejido (10).
El estudio de la patología pulmonar a través de la biología espacial puede proporcionar información valiosa sobre los mecanismos celulares subyacentes a las enfermedades respiratorias. Permite el mapeo detallado de los tipos de células dentro del tejido pulmonar, revelando sus relaciones e interacciones espaciales (8, 11). Este enfoque puede descubrir cómo las redes celulares se interrumpen en las condiciones de la enfermedad, contribuyendo a la inflamación, la remodelación de los tejidos y la pérdida de la función pulmonar observada en afecciones como el asma y la EPOC ((12,13,14) Desarrollos recientes en transcriptómica espacial han proporcionado información sobre el paisaje celular del pulmón humano en la salud y la enfermedad (15,16,17,18). Estos estudios han identificado nuevos estados celulares y compartimentos de tejido en los microambientes epiteliales, vasculares, estromales y nerviosos (15). El asma y la superposición de la EPOC se caracterizan por pacientes que se presentan con limitación persistente del flujo de aire y características de asma y EPOC. Por ejemplo, investigaciones recientes han revelado una firma de células T en pacientes con EPOC con infección fatal SARS-CoV-2 utilizando técnicas de perfil espacial pulmonar (19), que muestra que el parénquima pulmonar, las vías respiratorias y los vasos de los pacientes con EPOC han aumentado los linfocitos T con una respuesta de células T CD4 de memoria roma y una infección SARS-CoV-2 más invasiva (19). Otro estudio que utilizó la tecnología de secuenciación de ARN de células individuales identificó varios tipos de células distintas dentro de los pulmones de pacientes con EPOC, fumadores que no son COPD y nunca fumadores, observando una heterogeneidad extensa en las células epiteliales, particularmente en los grupos alveolares tipo 2 (AT2). Entre las células AT2, que generalmente se consideran progenitores alveolares, se identificó un subconjunto único que aumentó significativamente en los pacientes con EPOC y expresó específicamente una serie de quimiocinas (CXCL1, CXCL8). Esta subpoblación inflamatoria de las células AT2 siguió una ruta de diferenciación única y exhibió redes intercelulares significativamente aumentadas, lo que sugiere que puede desempeñar un papel crucial en el desarrollo de la EPOC (20, 21). Hacia el asma, un estudio reciente encontró ecosistemas celulares proinflamatorios dentro de nichos espaciales discretos en muestras de vías aéreas asmáticas caracterizadas por una mayor expresión de quimiocinas y alarmas, con combinaciones únicas de células estromales ((17). Dichos datos también revelan posibles mecanismos dentro de la mucosa de las vías respiratorias que impulsan la resistencia de la remodelación a las terapias antiinflamatorias. En general, estos enfoques de biología espacial subrayan las ventajas de una nueva dimensión en el estudio del pulmón, ofreciendo información sobre el paisaje celular y los microambientes tisulares en la salud y la enfermedad. En este sentido, si bien los enfoques de transcriptómica espacial proporcionan información sustancial sobre la heterogeneidad celular y la distribución de los patrones de genes, también existe el reconocimiento de que no todos los datos basados en genes son totalmente equivalentes a la expresión o distribución de proteínas. Por el contrario, los patrones de expresión de proteínas tienen el potencial de predecir la función y su heterogeneidad, incluidas las interacciones celulares o la matriz de células. En consecuencia, en el presente estudio, aplicamos enfoques de perfiles espaciales utilizando la tecnología de fusión Akoya Phenocycler (22,23,24,25) para explorar los pulmones humanos adultos normales, asmáticos y en la EPOC para comprender el microambiente celular y la identificación de las interacciones celulares dependientes del contexto.
Materiales y métodos
Especímenes de pulmón
Las muestras pulmonares quirúrgicas se obtuvieron incidentales a la cirugía torácica del paciente en Mayo Clinic Rochester, para enfermedad focal y no infecciosa (típicamente cánceres, carcinoma broncoalveolar excluido) bajo protocolos aprobados por IRB (Mayo IRB 08-002518). El consentimiento informado por escrito se obtuvo de los pacientes durante las visitas al consultorio en medicina, oncología o cirugía torácica por coordinadores de investigación experimentados (Mayo IRB 16-009655). Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación de la Clínica Mayo. Después de la escisión quirúrgica y los diagnósticos patológicos, las áreas normales del pulmón (distante de la patología focal) se identificaron y diseccionaron con la ayuda del patólogo quirúrgico. Las características clínicas se recopilaron del registro médico, y las variables relevantes o elementos de datos, como edad, género, FEV1, FVC y medicamentos, se extrajeron y seleccionaron para su inclusión en el conjunto de datos clínicos (tabla 1). Los pacientes fueron clasificados de acuerdo con su historial médico anterior en 3 cohortes: no atmáticos (n = 5), asmáticos (n = 4) y EPOC (n = 8).
Tabla 1 Tabla de características clínicas. Grupos no asmáticos versus asmáticos y EPOC de los que se usaron muestras pulmonares para la preparación de microarrays de tejido y estudios de perfiles espaciales. Las muestras fueron incidentales a la cirugía torácica del paciente en Mayo Clinic. Las características clínicas se recopilaron del registro médico, y las variables relevantes o elementos de datos, como edad, género, FEV1, FVC y medicamentos, se extrajeron y seleccionaron para su inclusiónMesa de tamaño completoLas muestras se conservaron en formato de parafina fijado con formalina (FFPE) utilizando protocolos estándar. Se construyeron microarrays de tejido (TMA) por cohorte que contenía 1–2 núcleos (1 mm de diámetro) por paciente. Incluimos controles no pulmonares como amígdalas, hígado y colon en cada TMA para permitir la validación de anticuerpos y procesos. Se prepararon secciones de tinción de hematoxilina y eosina (H&E) para proporcionar un contexto morfológico para los datos de inmunofluorescencia multiplex (Fig. Suplementaria. 1). La sección (espesor de 5 micrones) se cortó usando un microtomo Leica ( # RM2125) y se montaron en portaobjetos cargados positivamente (Fisher # 12-55-15). Los portaobjetos se secaron a temperatura ambiente durante la noche y se mantuvieron a 4 ° C para el almacenamiento a largo plazo durante no más de 5 días antes del análisis de proteómica para garantizar la calidad de la muestra.
Reactivos
Los anticuerpos conjugados con oligonucleótidos disponibles comercialmente fueron …
(Tagstotranslate) Biología espacial (T) Fenotipado funcional (T) Codex (T) Astma (T) COPD (T) Epitelio de la vía aérea (T) Mesenquima (T) Vecindades de células inmunes (T) Interacciones (T) Cell-Cell-Cell (T) Interacciones de matriz celular (T) Pneumología/Sistema Respiratorio
