Resumen
Antecedentes
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad inflamatoria crónica compleja y heterogénea que es una de las principales causas de las muertes estandarizadas por edad a nivel mundial. Si bien los estudios han investigado los efectos de la altitud en la EPOC, ninguno ha explorado las alteraciones homeostáticas de los macrófagos alveolares durante su patogénesis a grandes altitudes.
Métodos
Construimos un modelo de EPOC de gran altitud a través de la exposición de los macrófagos alveolares de ratón (MH-S) a hipoxia y extracto de humo de cigarrillo (CSE). La expresión del factor inducible por hipoxia (HIF) se cuantificó en células MH-S expuestas a hipoxia combinada con CSE y en el grupo de control. Se añadió ARN de horquilla corta de HIF-1α (shRNA) a las células MH-S. El transcriptoma se usó para caracterizar las vías de señalización aguas abajo de HIF-1α en células MH-S tratadas con hipoxia y exposición a CSE. Se utilizaron técnicas moleculares estándar para validar los resultados de la secuenciación de ARN.
Resultados
HIF-1α pero no HIF-2α se reguló significativamente en las células MH-S después de la exposición a hipoxia y CSE. El análisis de secuenciación de ARN de las células MH-S mostró que las vías relevantes aguas abajo de HIF-1α son principalmente inflamación, glucólisis, polarización M1, remodelación de la matriz extracelular y angiogénesis. La validación del análisis de secuenciación de ARN confirmó que las vías de señalización anteriores estaban reguladas anormalmente hacia arriba después de la exposición a CSE, y que la exposición hipóxica combinada exacerbó aún más la regulación ascendente aberrante inducida, que se inhibió después del tratamiento con shRNA HIF-1α.
Conclusión
Las vías de señalización de HIF-1α aguas abajo impulsan la inflamación, la polarización de los macrófagos M1, la glucólisis, la remodelación de la matriz extracelular y la angiogénesis, potencialmente interrumpiendo la homeostasis de los macrófagos alveolares durante la patogénesis de la copd de altitud de alta altitud. Esta interrupción puede ser una razón subyacente a la alta prevalencia de la EPOC en las regiones de gran altitud.
Introducción
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es la enfermedad respiratoria crónica más común y dañina en todo el mundo, y es una de las cuatro causas principales de muertes estandarizadas en la edad a nivel mundial desde 1990 hasta 2021 (1). Además, investigaciones recientes sugieren que la EPOC permanecerá entre las cuatro enfermedades mundiales principales para 2050 (2). Por lo tanto, es esencial estudiar los mecanismos de los diferentes fenotipos de la EPOC para mejorar el manejo individualizado de la EPOC, mejorar el pronóstico de la enfermedad y reducir la carga de la enfermedad.
Los entornos a gran altitud se caracterizan por diversas limitaciones físicas, incluida la radiación ultravioleta aumentada, la menor disponibilidad de oxígeno, temperaturas más frías y clima potencialmente más duro (3). Varios estudios anteriores han demostrado una mayor prevalencia y mortalidad de la EPOC a gran altitud (4,5,6). El efecto más significativo en los pacientes con EPOC es la hipoxia, debido a la disminución progresiva de la presión barométrica en comparación con los efectos del frío y el clima extremo (7). La familia de factores de transcripción de factor inducible por hipoxia (HIF) es un regulador importante de la respuesta celular a la hipoxia y juega un papel integral en la impulso de cambios metabólicos en las células que se adaptan a la disponibilidad hipóxica ((8). HIF juega un papel clave en el desarrollo pulmonar y la homeostasis, incluida la reparación y la angiogénesis y es un «centro» molecular clave en fisiología pulmonar y EPOC (9).
La EPOC ocurre debido a la exposición prolongada de los pulmones a partículas y gases tóxicos. Dichas exposiciones provocan una respuesta inmuneinflamatoria innata y adaptativa sostenida tanto en las vías respiratorias como en los tejidos pulmonares (10). Como las células efectoras inmunes innatas clave, los macrófagos reconocen, la fagocitosa y destruyen los patógenos y procesan partículas inhaladas, incluido el humo del cigarrillo y las partículas 2.5, que son los principales desencadenantes ambientales de la EPOC (11,12,13). Los macrófagos están abundantemente presentes en las vías respiratorias y las secreciones de pacientes con EPOC, y su abundancia está directamente relacionada con la gravedad de la EPOC (14). Estudios anteriores han demostrado desequilibrios homeostáticos en macrófagos de pacientes con EPOC, incluidas anormalidades en el reclutamiento, quimiotaxis, producción de mediador, fagocitosis y apoptosis (10, 11). Por lo tanto, el desequilibrio homeostático en los macrófagos alveolares juega un papel importante en la patogénesis de la EPOC.
Sin embargo, los cambios homeostáticos en los macrófagos en pacientes a gran altitud con EPOC no están claros. En este estudio, desarrollamos un modelo de hipoxia combinado con la exposición a CSE a imitar el estado de la enfermedad de la EPOC de gran altitud, y exploramos el efecto y el mecanismo de este modelo de enfermedad en la homeostasis de los macrófagos.
Métodos
Cultivo celular
Las células de macrófagos alveolares de ratón MH-S y las células de monocitos humanos THP-1 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina de 100 U/ml, 0,1 mg/ml de estreptomicina a 37 ° C en una incubadora humidificada. El medio se cambió al día siguiente y las células se pasaron al tercer día. Los monocitos THP-1 fueron inducidos a diferenciarse en macrófagos adherentes utilizando acetato de miristato de fosfor de 100 nM durante 24 h antes de todos los experimentos.
Extracción CSE
El CSE se preparó para uso inmediato en un extractor de vacío para la extracción de humo de cigarrillo. Los cigarrillos (Marlboro, MA, EE. UU.) Se extrajeron usando 10 ml de medio RPMI 1640 con un tiempo de extracción fijo de 5 min. La absorbancia del líquido se midió a 320 nm usando un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (TECAN). Cuando la absorbancia del líquido fue de 1.0, se consideró como 100% CSE y se diluyó en consecuencia.
Exposición a la hipoxia
El método Anaeropack se utilizó para establecer condiciones de crecimiento celular hipóxico (15). El dispositivo podría reducir la concentración de oxígeno al 1% (16,17,18). Brevemente, las células cultivadas en placas de cultivo de seis pocillos (Corning, Corning, NY, EE. UU.) Se colocaron en un barco hermético sellado. ANAEROPACK ™ Microaero (Mitsubishi Gas Chemical Corporation, Tokio, Japón) se colocó dentro del recipiente para crear un entorno hipóxico absorbiendo oxígeno y generando dióxido de carbono. Las células se incubaron en un recipiente hipóxico a 37 ° C en una incubadora humidificada durante 24 h.
Construcción de vectores lentivirales que modulan la expresión de HIF-1α y la transducción celular
El shRNA de control negativo, dirigido a shRNA y vector HIF-1α se obtuvo de Genechem (Shanghai, China). El procedimiento fue el siguiente: primero, se diseñaron tres shRNA de secuencia objetivo y un shRNA de control, y los productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se sintetizaron de acuerdo con estos diseños y se clonaron en la parte central del vector lentiviral GV493. El shRNA relevante, la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) y el gen de resistencia a la puromicina se expresaron en GV493. El vector se transformó luego en E. coli (DH5α) y PCR identificó transformantes positivos por PCR. Luego transfectamos 293 células T durante 48 h con la mezcla de plásmidos (GV493 con los plásmidos de empaquetado auxiliares Helper 1.0 y Helper 2.0 en la relación GV: Helper 1: Helper 2 = 20: 15: 10 µg) usando reactivo de transfección Genechem.
Durante la transducción, las células MH-S se infectaron con lentivirus a una multiplicidad de 50 de infección durante 24 h. Después de 72 h de cultivo, se observó una expresión de proteína fluorescente verde mejorada utilizando un microscopio de fluorescencia (Eclipse Nikon) para evaluar la eficiencia de la transducción y aplicar las líneas celulares con eficiencia adecuada (> 80%). A continuación, verificamos su expresión de HIF-1α por reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa cuantitativa (RT-QPCR). Luego, la selección de puromicina se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante (concentraciones de 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 y 10 μg/ml, con 5 µg/ml que es el óptimo) en el orden de la generación de la transfección.
Secuenciación de ARN a granel
Aislamos el contenido de ARN completo de las células MH-S. La preparación de la biblioteca se realizó utilizando el kit de preparación de la biblioteca de ARNm de doble modo dual (BGI-Shenzhen, China). Los nanoballs de ADN (DNB) se realizaron con un producto de ADN ciclado monocatenario. Los DNB se cargaron en nanoarrays estampados para generar lecturas de base PE 100/150 en una plataforma G400/T7/T10 (BGI, Shenzhen, China). Luego realizamos un análisis bioinformático de los resultados de secuenciación. Para una descripción detallada de los materiales y métodos, consulte el archivo adicional 1. Los grupos en el análisis bioinformático incluyeron el grupo N_N (Medio DMEM), el grupo N_CSE (expuesto a CSE solo), el grupo N_HY (expuesto a la hipoxia sola) y el grupo N_CSEHY (expuesto a la hipoxia combinada con CSE); Grupo NC_N (SHRNA de control negativo, medio DMEM), grupo NC_CSEHY (shRNA de control negativo, expuesto a hipoxia combinada con CSE), grupo LV_N (dirigido a shRNA HIF-1α, medio DMEM) y grupo LV_CSEHY (dirigido a shRNA HIF-1α, hipoxia expuesta combinada con CSE).
Viabilidad celular
Las células MH-S (3 × 104) tratadas con hipoxia y diferentes concentraciones de CSE se sembraron en placas de 96 pocillos, y la viabilidad celular se determinó 24 h más tarde midiendo la absorbancia a 450 nm usando un kit de conteo de células (Elabsciencia, E-CK-A362).
PCR de transcripción inversa cuantitativa
El ARN completo se extrajo de las células utilizando el procedimiento de trizol-cloroformo-isopropanol, seguido de una transcripción inversa usando el kit de síntesis de un solo paso de ADNc de Takara (Takara, RR036A). Se usó la mezcla maestra de PCR Green PCR de potencia (Takara, RR420A) para QPCR. Se realizó la normalización de la cantidad de transcripciones a la cantidad de 18s. Etable 1 enumera los cebadores utilizados en este estudio.
Transferencia Western
Los lisados celulares se prepararon usando el tampón RIPA (Beyotime, P0013b) que contenía un inhibidor de la fosfatasa (Roche Diagnostics GmbH, 04–906-837–001) y un cóctel completo del inhibidor de la proteasa (Roche Diagnostics GmbH, 4,693,132,001–20). Se usó un kit de ensayo de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) Para medir la concentración total de proteínas. Las proteínas se separaron usando electroforesis en gel SDS -Poliacrilamida al 10% (Shanghai Abilify Biomedical Technology Co., Ltd.) y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (Merck, Darmstadt, Alemania). La membrana se incubó …
(Tagstotransilato) Enfermedad pulmonar obstructiva crónica (T) hipoxia (T) Extracto de humo de cigarrillo (T) HIF-1α (T) Macrófagos alveolar Homeostasis (T) Sistema de neumología/respiratorio
