Resumen
Antecedentes
La identificación y validación de posibles biomarcadores podría facilitar la identificación de la hipertensión arterial pulmonar (HAP) y, por tanto, ayudar a estudiar su papel en el proceso de la enfermedad.
Métodos
Utilizamos la etiqueta isobárica para enfoques de cuantificación relativa y absoluta para comparar los perfiles de proteínas entre el suero de pacientes con HAP y los controles. Se realizaron análisis bioinformáticos y la identificación por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de pacientes con HAP y los controles para identificar los biomarcadores potenciales. Se utilizó el análisis de la curva característica operativa del receptor (ROC) para evaluar el rendimiento diagnóstico de estos biomarcadores potenciales. El análisis de aleatorización mendeliana (MR) aclaró aún más la relación entre los biomarcadores potenciales y la HAP. Además, los niveles de expresión de los biomarcadores potenciales se validaron aún más en dos modelos animales de HAP (monocrotalina-PH y Sugen5416 más hipoxia-PH) utilizando ELISA y PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR).
Resultados
Identificamos cambios significativos en tres proteínas, incluida la heparanasa (HPSE), la gelsolina (GSN) y el activador del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFA) en pacientes con HAP. El análisis ROC mostró que las áreas bajo la curva de HPSE, GSN y HGFA para diferenciar a los pacientes con HAP de los controles fueron 0,769, 0,777 y 0,964, respectivamente. HGFA se correlacionó con múltiples parámetros de las funciones del ventrículo derecho en pacientes con HAP. Además del análisis proteómico, también utilizamos el método de resonancia magnética para demostrar el vínculo causal entre los niveles de HGFA genéticamente reducidos y un mayor riesgo de HAP. En un estudio de validación posterior en modelos animales de HAP, los niveles de expresión de ARNm de HGFA en los tejidos pulmonares fueron significativamente más bajos en modelos de ratas con HAP que en los controles. En los modelos de ratas, los niveles séricos de HGFA fueron más bajos en comparación con el grupo de control y mostraron una correlación negativa con la presión sistólica del ventrículo derecho.
Conclusión
El estudio demostró que HGFA podría ser un biomarcador prometedor para la detección no invasiva de HAP.
Introducción
La hipertensión arterial pulmonar (PAH) es una enfermedad potencialmente mortal caracterizada por un aumento sostenido de la presión arterial pulmonar media (PAPm) debido al aumento de la resistencia vascular pulmonar (PVR) (1). Los síntomas son siempre inespecíficos y suelen incluir disnea y fatiga de esfuerzo. Además, la HAP es una enfermedad caracterizada por la oclusión progresiva de pequeñas arterias pulmonares y una falta de angiogénesis pulmonar compensadora.2), resultando así en hipertrofia ventricular derecha y remodelación vascular (3) con malos resultados, incluida insuficiencia ventricular derecha (4) y la muerte (5).
Los avances recientes en las intervenciones terapéuticas se han mostrado prometedores a la hora de ampliar la vida activa de las personas afectadas. A pesar de estos avances, el diagnóstico de la HAP sigue siendo un desafío. Los primeros síntomas son atípicos y pueden imitar otros padecimientos cardiorrespiratorios, lo que a menudo resulta en un diagnóstico erróneo o un diagnóstico tardío. Además, el diagnóstico preciso de la HAP depende del cateterismo cardíaco invasivo. En general, existe una necesidad crítica de un biomarcador preciso para la detección temprana de la HAP.
Los avances recientes en el campo de la proteómica han allanado el camino para el descubrimiento de nuevos biomarcadores de enfermedades. Específicamente, las etiquetas isobáricas para análisis proteómico basado en cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) han surgido como una potente herramienta para la identificación de biomarcadores en diversas enfermedades (6, 7). Sin embargo, falta la aplicación de la proteómica en el contexto de la HAP, con evidencia limitada centrada en este campo (8, 9). Este enfoque tiene el potencial no sólo de mejorar nuestra comprensión de la fisiopatología de la HAP, sino también de revolucionar su panorama diagnóstico.
Nuestro estudio utilizó la proteómica para explorar las características del proteoma plasmático de los pacientes con HAP. Se realizaron análisis bioinformáticos y la identificación por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de pacientes con HAP y los controles para identificar los biomarcadores potenciales. El estudio de validación posterior se realizó en modelos animales de HAP.
Materiales y métodos
Cohorte de estudio y declaración de ética.
Los pacientes con HAP se reclutaron retrospectivamente entre pacientes respiratorios hospitalizados en el Hospital de la Amistad China-Japón y los controles sanos se reclutaron en el centro de examen físico durante el mismo período. La población que incluimos se dividió en dos partes. En primer lugar, se incluyeron nueve pacientes con HAP en el estudio iTRAQ para descubrir proteínas diferenciales en 2020. A continuación, el otro grupo de pacientes con HAP (28 HAP) se utilizó para la posterior validación ELISA en 2023. De acuerdo con las Directrices ESC/ERS de 2022 para el diagnóstico y tratamiento de la hipertensión pulmonar (HP) (10), los sujetos inscritos con PAH en el momento del reclutamiento, según lo definido por la clasificación del Grupo 1, debían tener un cateterismo del corazón derecho (RHC) que demostrara mPAP > 20 mmHg, presión de enclavamiento de la arteria pulmonar (PAWP) ≤ 15 mmHg y PVR > 2 unidades de madera (10). El estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación del Hospital de la Amistad China-Japón y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes de la inscripción.
Procesamiento de muestras de sangre y perfiles proteómicos.
Se recogieron muestras de sangre en el momento del diagnóstico inicial y se centrifugaron poco después de la formación del coágulo. Todas las muestras se almacenaron a –80 °C en alícuotas y se descongelaron solo antes de la prueba. Para identificar proteínas específicas de la HAP, se combinaron volúmenes iguales de muestras de suero de 9 pacientes con HAP y 9 sujetos de control para el análisis iTRAQ. Se utilizó ProteoMiner para eliminar las proteínas de alta abundancia de las muestras. Las mezclas de péptidos de cada grupo se marcaron utilizando el kit iTRAQ Reagent-8 Plex Multiplex (Applied Biosystem). Los péptidos digeridos se marcaron con etiquetas iTRAQ (reactivo 114: PAH; reactivo 118: Control). Los péptidos marcados de cada grupo se separaron utilizando un sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Luego, se realizó un análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC-MS/MS) en Q-Exactive MS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.).
Búsqueda de bases de datos y análisis bioinformático.
Los datos originales del ensayo iTRAQ se recopilaron mediante espectrometría de masas y la búsqueda en la base de datos se realizó utilizando el software Proteome Discoverer (versión 1.3). La desviación de la calidad primaria fue de 15 ppm y la desviación de la calidad secundaria de 20 mmu. La base de datos era la base de datos humana UniProt-Swiss (incluidas 20.443 proteínas anotadas, publicada el 2019.07). Se llevó a cabo la transformación log2 del valor cuantitativo original para convertirlo en una distribución normal.
Para identificar proteínas expresadas diferencialmente (DEP) entre los grupos PAH y control, las proteínas con cambio de veces ≥ 1,20 y valor de P <0,05 según la prueba t se definieron como reguladas al alza; las proteínas con cambio de veces ≤ 0,83 y un valor de P <0,05 mediante la prueba t se definieron como reguladas negativamente. Se realizaron análisis bioinformáticos adicionales utilizando R Studio y otros sitios web necesarios. Los gráficos de volcanes fueron realizados por R Studio con el paquete R “ggplot2”. R Studio generó análisis de anotaciones de rutas de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) con los paquetes R “clusterProfiler”. Los DEP se enviaron a la base de datos STRING 11.5 para la red de interacción proteína-proteína (PPI).
Verificación de expresión diferencial por ELISA.
La identificación de proteínas candidatas para una mayor validación se basó en (1) la expresión diferencial en pacientes y controles con HAP; y (2) posible importancia funcional o patológica en la HAP. Los biomarcadores candidatos heparanasa (HPSE), gelsolina (GSN), activador del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFA), proteína amiloide A1 sérica (SAA1) y proteína 1 de la matriz extracelular (ECM1) se validaron adicionalmente utilizando kits ELISA tipo sándwich disponibles comercialmente (Abcam, Waltham , MA, EE. UU. o R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se interpolaron a partir de la curva de referencia estándar proporcionada con cada kit.
Análisis de aleatorización mendeliana (MR) de todo el proteoma
Se utilizó RM para verificar si HGFA estaba asociado con HAP (11). En primer lugar, adquirimos las estadísticas resumidas más grandes del Estudio de asociación de todo el genoma de la PAH (GWAS). Este PAH GWAS utilizó datos de cuatro estudios internacionales de casos y controles en 11.744 personas con ascendencia europea (12). A continuación obtuvimos loci de rasgos cuantitativos de proteína sérica (13). En el análisis de RM, se utilizaron polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) relevantes para las proteínas como variables instrumentales (IV) para probar el efecto causal de la exposición (expresión de HGFA) en el resultado (PAH). Para el análisis de RM, se utiliza el método ponderado por varianza inversa (IVW) (14) se utilizó como análisis de RM principal. Se estableció como nivel de significancia un valor AP < 0,05.
Validación de la expresión génica en el conjunto de datos GSE113439.
Para una validación en profundidad de la precisión de los biomarcadores clave, GSE113439 (15) se utilizó para comparar la expresión genética entre los grupos PAH y control. GSE113439 es un conjunto de datos público derivado de la base de datos GEO. GSE113439 se basa en la plataforma GPL6244 (Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array) y contenía 6 pacientes con HAP idiopática y 11 controles (tejidos pulmonares) para información transcriptómica. Comparamos la expresión genética de biomarcadores clave entre la HAP y los controles. La curva de características operativas del receptor (ROC) y el área bajo la curva se utilizaron para evaluar el valor diagnóstico de la proteína identificada para la HAP.
Construcción de modelos animales PAH
Se compraron ratas macho adultas Sprague-Dawley (SD) (6 semanas de edad, 150-170 g) de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética de Animales de Laboratorio del Hospital de la Amistad China-Japón (IACUC). Número de edición: ZRDWLL240016). En este estudio, las ratas macho SD fueron inicialmente aleatorizadas en dos grupos: el grupo monocrotalina (MCT)-PH fue sometido a una única inyección subcutánea en el…
