El ADN mitocondrial en el líquido de lavado broncoalveolar se asocia con el pronóstico de la fibrosis pulmonar idiopática: un estudio de cohorte única

Resumen

Antecedentes

El ADN mitocondrial extracelular (ADNmt) se libera de las células dañadas y aumenta en el suero y en el líquido de lavado broncoalveolar (LBLA) de los pacientes con fibrosis pulmonar idiopática (FPI). Si bien se ha informado que los niveles elevados de ADNmt sérico están relacionados con la progresión de la enfermedad y el desarrollo futuro de exacerbación aguda (EA) de la FPI (EA-FPI), la importancia clínica del ADNmt en el LBA (LBA-ADNmt) sigue sin estar clara. Investigamos las relaciones entre los niveles de ADNmt en el LBA y otras variables clínicas y el pronóstico en la FPI.

Métodos

Se determinaron los niveles de mtADN extracelular en muestras de líquido cefalorraquídeo (BALF) obtenidas de pacientes con FPI mediante PCR digital en gotas. También se determinaron los niveles de ADN nucleolar extracelular en el BALF (BALF-nucADN) como marcador de colapso celular simple. Se revisaron retrospectivamente las características de los pacientes y la información de supervivencia.

Resultados

Los niveles de mtADN en suero y en el líquido cefalorraquídeo no se correlacionaron entre sí. En 27 pacientes con muestras pareadas de líquido cefalorraquídeo obtenidas en un estado estable y en el momento del diagnóstico de EA, los niveles de mtADN en el líquido cefalorraquídeo aumentaron significativamente en el momento del EA. Los niveles elevados de mtADN en el líquido cefalorraquídeo se asociaron con inflamación o función pulmonar alterada en un estado estable (n = 90), mientras que se asociaron con la edad y los neutrófilos en el líquido cefalorraquídeo en el momento del EA (n = 38). Un BALF-mtDNA ≥ 4234,3 copias/µL en estado estable (tiempo de supervivencia media (MST): 42,4 frente a 79,6 meses, p < 0,001) y ≥ 11.194,3 copias/µL en el momento del EA (MST: 2,6 frente a 20,0 meses, p = 0,03) se asociaron con una supervivencia más corta después de la recolección del BALF, incluso después de ajustar otros factores pronósticos conocidos. Por otro lado, el BALF-nucDNA mostró diferentes tendencias en correlación con otras variables clínicas y no mostró ninguna asociación significativa con el tiempo de supervivencia.

Conclusiones

El aumento de BALF-mtDNA se asoció con un mal pronóstico tanto en la FPI como en la EA-FPI. Cabe destacar que, en el momento de la EA, diferenció claramente a los sobrevivientes de los no sobrevivientes. Dadas las tendencias mostradas por los análisis de BALF-nucDNA, la elevación de BALF-mtDNA podría no reflejar simplemente el impacto del colapso celular. Se requieren más estudios para explorar los mecanismos subyacentes y las aplicaciones clínicas de BALF-mtDNA en la FPI.

Introducción

La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad pulmonar crónica, progresiva y fibrótica con un tiempo de supervivencia medio (TSM) de 3 a 5 años (1). La exacerbación aguda (EA) es una complicación devastadora de la FPI con una duración media de supervivencia de sólo 3 meses (2). Aunque se ha identificado que algunos factores de crecimiento profibróticos, citocinas y quimiocinas contribuyen a la enfermedad, su patogenia aún no se comprende por completo. Dado el mal pronóstico de los pacientes con FPI y EA-FPI, es crucial comprender a fondo su patogenia e identificar biomarcadores clínicamente importantes.

El ADN mitocondrial extracelular (ADNmt) es una de las moléculas de patrón molecular asociadas al peligro (DAMP) liberadas por las células estresadas, se une a los receptores de reconocimiento de patógenos, activa los sistemas inmunológicos e induce una respuesta inflamatoria. En la FPI, se supone que la disfunción mitocondrial y los cambios metabólicos inducidos por los estímulos profibróticos y las señales mecánicas desencadenan la liberación de ADNmt de las células pulmonares, como los fibroblastos (3) y células epiteliales alveolares (4). De acuerdo con esto, los niveles de mtADN están elevados tanto en suero (3,4,5,6,7) y el líquido de lavado broncoalveolar (LBAL) (3, 4) en pacientes con FPI. Si bien los niveles séricos de ADNmt están asociados con el tiempo de supervivencia (3, 7), gravedad o progresión de la enfermedad (4, 5, 7) y la aparición de EA (6), la importancia clínica del ADNmt en el líquido cefalorraquídeo (BALF-ADNmt) no ha sido bien estudiada.

En los últimos 10 a 20 años, la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) digital, una mejora de los métodos de PCR convencionales, se ha utilizado cada vez más con fines experimentales y clínicos. La PCR digital de gotas (ddPCR) es una de esas técnicas novedosas. Permite la detección precisa de un número muy pequeño de objetivos en comparación con los métodos convencionales y una cuantificación absoluta sin necesidad de una curva estándar (8, 9) utilizando muestras clínicas crudas sin los pasos de extracción de ADN que requieren mucho tiempo y trabajo (10).

En este estudio, establecimos un protocolo para medir el BALF-mtDNA utilizando ddPCR y evaluamos su importancia clínica en la FPI, incluido el valor como posible biomarcador pronóstico tanto en estados estables como en EA.

Métodos

Población de estudio y recolección de datos

Desde agosto de 2009 hasta mayo de 2017, recolectamos muestras de líquido broncoalveolar de 101 pacientes con FPI que se sometieron a un lavado broncoalveolar (BAL) en el Hospital General de Tosei. De ellos, 90 pacientes proporcionaron muestras de líquido broncoalveolar durante un estado estable, 38 pacientes las proporcionaron en el momento de su primer EA y 27 de ellos se sometieron a un BAL tanto en un estado estable como en el momento del EA. Un subconjunto de estos pacientes también proporcionó muestras de sangre. Durante un estado estable, 57 de los 90 pacientes proporcionaron muestras de sangre dentro de los 3 meses anteriores o posteriores a la realización del BAL. En el momento del primer EA, 36 de los 38 pacientes proporcionaron muestras de sangre al mismo tiempo que el BAL.

En todos los pacientes se reconfirmó la validez del diagnóstico de FPI según las últimas directrices (11) a través de discusiones multidisciplinarias. El diagnóstico de EA también se reconfirmó como un evento clínico que cumple con los criterios descritos en un informe internacional publicado en 2016 (2). El tratamiento de los EA siguió un protocolo estandarizado: terapia en pulsos de metilprednisolona (1 g/día durante 3 días/semana) durante dos ciclos, seguida de 1 mg/kg/día de metilprednisolona. La dosis de esteroides se redujo gradualmente a 10 mg/día de prednisolona oral dentro de las 4-6 semanas posteriores al inicio del tratamiento. Se administró ciclosporina o tacrolimus simultáneamente. La prednisolona y los inmunosupresores se continuaron durante al menos algunos meses después de la recuperación.

Las características de los pacientes y los resultados de las pruebas se recopilaron retrospectivamente de las historias clínicas. Los resultados de los análisis de sangre y de las pruebas de función pulmonar se registraron dentro de los 3 meses anteriores al lavado broncoalveolar en el caso de los pacientes en estado estable. La capacidad vital forzada (FVC) y la capacidad de difusión del pulmón para el monóxido de carbono (DLCO) se expresaron como un porcentaje de los valores previstos. Para calcular la presión parcial de oxígeno arterial (PaO2)/fracción de oxígeno inspiratorio (FiO2), se asumió aproximadamente que FiO2 era 0,21 + 0,04 × flujo de oxígeno (L/min) cuando se utiliza una cánula nasal, y 0,60 + 0,10 × (flujo de oxígeno – 6 L/min) cuando se utiliza una mascarilla sin rebreather. Para los datos en el momento de la EA-FPI, la FVC y la DLCO iniciales se habían registrado dentro de los 6 meses anteriores al diagnóstico de EA. La fecha de seguimiento final de este estudio fue el 30 de abril de 2022.

Coleccion de muestra

Se recogieron muestras de sangre y de líquido balsámico de pacientes que dieron su consentimiento informado por escrito de conformidad con la Declaración de Helsinki. El lavado balsámico se realizó de acuerdo con el protocolo estandarizado (12).

Consulte la Información complementaria para conocer el protocolo detallado para el procesamiento de BALF y sangre y la ddPCR posterior.

análisis estadístico

Las variables continuas se presentaron como la mediana con un rango intercuartil debido a una distribución no normal, y se utilizaron la prueba de rangos con signo de Wilcoxon y la prueba U de Mann-Whitney para las comparaciones entre grupos, según correspondiera. Las variables categóricas se resumieron por número y porcentaje. Se aplicó la prueba de correlación de rangos de Spearman para evaluar la correlación entre dos variables continuas. El método de Benjamini y Hochberg (13) se utilizó para ajustar la tasa de descubrimiento falso para pruebas múltiples.

Medimos el tiempo de supervivencia desde la fecha del lavado broncoalveolar hasta la fecha de fallecimiento. Se realizaron análisis de curvas ROC dependientes del tiempo para determinar los valores de corte óptimos para BALF-mtDNA y BALF-nucDNA para predecir el tiempo de supervivencia y determinar el área bajo la curva (AUC). Se utilizaron modelos de riesgos proporcionales de Cox para evaluar las asociaciones entre las variables y el tiempo de supervivencia, ajustando los factores demográficos conocidos que se asocian con el tiempo de supervivencia.

Utilizamos una prueba bilateral para todos los análisis estadísticos y consideramos que los valores p < 0,05 eran estadísticamente significativos. Los análisis se realizaron con R Commander (The R Foundation for Statistical Computing, Viena, Austria).

Resultados

Factores correlacionados con BALF-mtDNA y BALF-nucDNA

Mesa 1 La figura muestra las características de los pacientes en el momento del lavado broncoalveolar. Entre los pacientes que proporcionaron muestras de líquido broncoalveolar y de suero al mismo tiempo, no encontramos correlaciones significativas entre los niveles de mtADN y nucADN, ni en un estado estable ni en el momento del EA (fig. 1A, B). Entre aquellos que proporcionaron muestras de BALF tanto en un estado estable como en el momento de la EA, los niveles de BALF-mtDNA y BALF-nucDNA aumentaron significativamente en el momento de la EA en comparación con aquellos en un estado estable (Fig. 1C).

Tabla 1 Características de los pacientes en el momento de la recolección del BALFMesa de tamaño completoFigura 1

Correlación de los genes diana en el líquido cefalorraquídeo con los del suero y la aparición de EA. A, B Los números de copias de los genes diana en el líquido cefalorraquídeo y el suero tampoco se correlacionaron significativamente entre sí (A) en un estado estable (n = 57) o (B) en el momento del primer EA (n = 36), determinado por ddPCR. C Los niveles de mtDNA y nucDNA en el líquido bronquial alveolar determinado por ddPCR aumentaron significativamente en el momento del primer EA en comparación con aquellos en un estado estable (n = 27). Las medianas y los rangos intercuartiles para los valores de cada diana fueron: mtDNA, estable: 5575,7 (4478,6 – 8511,4) frente a EA: 15 441,4 (6467,1 – 29 678,6) copias/µL; nucDNA, estable: 137,1 (79,7 – 201,0) frente a EA: 318,9 (134,1 – 660,0) copias/µL. LBA: líquido de lavado broncoalveolar; mtDNA: ADN mitocondrial; nucDNA: ADN nucleolar, EA exacerbación aguda; ddPCR: reacción en cadena de la polimerasa digital en gotas; ** P < 0,01; **** P < 0,0001

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Exploramos las variables clínicas correlacionadas con los niveles de BALF-mtDNA y -nucDNA. En un estado estable, la exposición al humo de cigarrillo (paquete-año), DLCO y PaO2/FiO2 mostraron una correlación negativa con BALF-mtDNA…

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