DNA-PKcs participó en la hipertensión pulmonar hipóxica

Resumen

Fondo

La hipertensión pulmonar hipóxica (HPH) es una complicación común de la enfermedad pulmonar crónica, que afecta gravemente la supervivencia y el pronóstico de los pacientes. Varios informes recientes han demostrado que el daño y la reparación del ADN desempeñan un papel crucial en la patogenia de la hipertensión arterial pulmonar. La subunidad catalítica de proteína quinasa dependiente de ADN (DNA-PKcs) como parte de DNA-PK es un sensor molecular para el daño del ADN que mejora la reparación de DSB. Este estudio tuvo como objetivo demostrar la expresión y el mecanismo potencial de DNA-PKcs en la patogénesis de HPH.

Métodos

Los niveles de ADN-PKcs y otras proteínas en explantes de arteria pulmonar humana y de ratas de tejidos pulmonares y células de músculo liso de arteria pulmonar (PASMC) se midieron mediante inmunohistoquímica y análisis de transferencia Western. Los niveles de expresión de ARNm de ADN-PKcs y NOR1 en PASMC se cuantificaron con qRT-PCR. Mientras tanto, la interacción entre las proteínas se detectó mediante ensayos de co-inmunoprecipitación (Co-IP). La proliferación celular y la apoptosis se evaluaron mediante el ensayo del kit 8 de recuento de células (CCK-8), la incorporación de EdU y la citometría de flujo. Se construyeron modelos de HPH en ratas para verificar el papel de las DNA-PKcs en la remodelación vascular pulmonar in vivo.

Resultados

Los niveles de proteína DNA-PKcs aumentaron significativamente en explantes de arteria pulmonar de modelos HPH y tejidos pulmonares de pacientes con hipoxemia. En las PASMC humanas, la hipoxia regulaba al alza las ADN-PKc de una manera dependiente del tiempo. La regulación a la baja de DNA-PKcs por siRNA dirigido o inhibidor de molécula pequeña NU7026 indujo tanto la inhibición de la proliferación celular como la detención del ciclo celular. DNA-PKcs afectó la proliferación al regular la síntesis de proteína NOR1 seguida de la expresión de ciclina D1. La co-inmunoprecipitación de NOR1 con DNA-PKcs aumentó severamente en hipoxia. Mientras tanto, la hipoxia promovió G2+ fase S, mientras que la regulación negativa de DNA-PKcs y NOR1 atenuó los efectos de la hipoxia. In vivo, la inhibición de DNA-PKcs revierte la remodelación vascular pulmonar hipóxica y previene HPH.

Conclusiones

Nuestro estudio indicó el mecanismo potencial de DNA-PKcs en el desarrollo de HPH. Podría proporcionar información sobre nuevos objetivos terapéuticos para la remodelación vascular pulmonar y la hipertensión pulmonar.

Introducción

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad progresiva caracterizada por inflamación crónica de las vías respiratorias y destrucción del parénquima pulmonar. [1, 2]. La hipertensión pulmonar del grupo 3 (hipertensión pulmonar hipóxica, HPH) es el segundo tipo más común de HP. Se debe principalmente a la hipoxemia. [3, 4]. Evidencia reciente sugiere que del 5% al ​​10% de los pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) se complican con frecuencia por el desarrollo de HPH, con una mayor tasa de mortalidad. [1,2,3,4].

La hipertensión pulmonar hipóxica (HPH) es una complicación común resultante de varias enfermedades respiratorias crónicas, que puede causar un mal pronóstico de los pacientes. [1,2,3]. La oxigenoterapia es la modalidad principal, ya que en la práctica clínica no existen fármacos dirigidos molecularmente efectivos para los pacientes con HPH [4, 5]. Es urgente encontrar nuevas dianas terapéuticas. Desde una perspectiva patológica, la principal causa de HPH es la constricción vascular pulmonar inducida por hipoxia y la remodelación de la estructura. [6,7,8]. Y el remodelado vascular pulmonar en condiciones hipóxicas es el principal factor anatómico para inducir hipertensión pulmonar irreversible. [9, 10]. Por lo tanto, necesitamos un estudio en profundidad de su patogenia, que tiene una importancia clínica importante para la prevención y el tratamiento de la HPH.

La respuesta al daño del ADN (DDR) es un fenómeno fisiológico en la parte del metabolismo celular para mantener la estabilidad genómica [11,12,13]. Además de las actividades metabólicas normales, muchos factores exógenos, como medicamentos, hipoxia e inflamación, podrían provocar daños en el ADN. Hay muchos genes involucrados en DDR, incluido el punto de control quinasa 1 (CHK1), poli(ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1), Pim-1, proteína de choque térmico mitocondrial 90 (HSP90), etc. Varios estudios han demostrado inhibidores farmacológicos específicos como MK-8776 (inhibidor de CHK1), ABT-888 (inhibidor de PARP1), SGI-1776 (inhibidor de PIM1) y gamitrinib (inhibidor de HSP90 mitocondrial) regularon a la baja sus genes objetivo, lo que provocó una proliferación reducida y un aumento de la apoptosis, lo que sugiere su potencial terapéutico en HAP [14,15,16,17,18].

Las roturas de doble cadena del ADN son una forma perjudicial pero común de daño en el ADN. Se puede reparar predominantemente mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) [19]. DNA-PKcs (subunidad catalítica de proteína quinasa dependiente de ADN, NIH-NCBI gen 5591) como una enzima crítica se ha implicado en NHEJ [20, 21]. Informes recientes encontraron que la activación excesiva del daño en el ADN fue importante para el desarrollo de HAP. [16, 22,23,24]. Sin embargo, actualmente no hay evidencia suficiente para respaldar que la reparación del ADN tenga una asociación causal directa con HPH.

Además, es bien sabido que Nur77(NR4A1), Nurr1(NR4A2) y NOR1(NR4A3) son miembros de la subfamilia NR4A de receptores nucleares huérfanos. [25, 26]. Y un estudio anterior mostró que los receptores huérfanos nucleares NR4A estaban asociados con la reparación de DSB al promover el ensamblaje de ADN-PK en lesiones de ADN [27]. Mientras tanto, otros estudios han demostrado que NOR1 puede desempeñar un papel crucial en la regulación de la proliferación de células del músculo liso. [28,29,30]. Nuestros estudios anteriores y recientes han demostrado que NOR1 puede promover la proliferación de células del músculo liso de la arteria pulmonar (PASMC) al modular la expresión de ciclina D1 en HAP [31,32,33]. Algunos otros estudios también mostraron que la vía de la ciclina D1 está involucrada en la regulación de la reparación del ADN en tipos de células como las células cancerosas y las células del músculo liso vascular. [34, 35]. Pero aún se desconoce si NOR1/ciclinaD1 está relacionado con el progreso de la reparación del ADN en PASMC en condiciones de hipoxia.

Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la DNA-PKcs afecta la proliferación de PASMC humana al regular la síntesis de la proteína NOR1 seguida de la ciclina D1 y, finalmente, conduce a la remodelación vascular pulmonar hipóxica en HPH.

materiales y métodos

Recolección de muestras de sujetos humanos

Este estudio fue aprobado por el comité de ética de investigación del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Soochow y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos. En este estudio, recolectamos tejidos pulmonares de 10 casos de EPOC con hipoxemia y 12 pacientes controles en nuestro hospital. Se obtuvieron muestras de pulmón humano de pacientes que se sometieron a neumonectomía por reducción del volumen pulmonar (EPOC con hipoxemia) o carcinoma de pulmón (controles). Los explantes de arteria pulmonar se separaron de las muestras de pulmón del grupo de EPOC o del grupo de control como se describe en nuestro estudio anterior. [26]. Las muestras de tejido pulmonar y los explantes de arterias pulmonares se almacenaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Mientras tanto, todos los participantes se han ofrecido con el consentimiento informado por escrito en este reclutamiento.

Cultivo de células

Los PASMC humanos fueron amablemente donados por el Instituto de Enfermedades Respiratorias de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, Wuhan, China. Todas las células se cultivaron en DMEM, suplementadas con suero fetal bovino (FBS) al 10 %, L-glutamina al 1 % y antibióticos (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.25% CO2) o hipoxia (5% O25% CO2).

transfección

GenePharma (Suzhou, China) diseñó y sintetizó ARN de interferencia dirigidos a ADN-PK y siARN codificados de control negativo. Se seleccionaron secuencias específicas de ARN de interferencia (siARN) para ADN-PKc en base a una publicación anterior [35]. Las secuencias de siRNA son las siguientes: siRNA-DNA-PK sentido 5′-GAUCGCACCUUACUCUGUUTTdTdT-3′; siRNA-NC sentido 5′UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3′.

Las PASMC se sembraron en 6 placas de pocillos a una densidad de 2 × 105 células/pocillo. Luego, las células se transfectaron con Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Análisis de proliferación celular

La proliferación celular se midió utilizando el kit de ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Boster, Wuhan, China) y…

Truncado en 8000 caracteresTraducido automáticamente
Publicación Original

¿Quieres recibir semanalmente y gratuitamente todos los contenidos de Fisio One?

Artículos relacionados