Resumen
Antecedentes
La inflamación y la desregulación inmunológica están involucradas en la consecuencia del tromboembolismo pulmonar poco común (PTE) conocida como hipertensión pulmonar tromboembólica crónica (CTEPH). Aunque las muestras de tejido son proporcionadas por la endarterectomía pulmonar (PEA), la accesibilidad está restringida por su complejidad técnica. Las células inmunes que se encuentran en la sangre periférica pueden proporcionar información sobre cómo se desarrolla una enfermedad.
Métodos
Desarrollamos un método de citometría de flujo de 7 colores usando 200 µl de sangre periférica para analizar las subpoblaciones de células inmunes y los agregados de células inmunes de plaquetas en CTEPH. Los tejidos de guisantes se usaron para la validación de inmunofluorescencia. Empleamos el análisis de correlación y la regresión lineal para examinar las relaciones entre la desregulación de las células inmunes y la gravedad de CTEPH.
Resultados
Hubo 36 controles sanos de edad y sexo, 10 pacientes con otros subtipos de hipertensión pulmonar (pH) excepto CTEPH, 20 pacientes con PTE y 62 pacientes con CTEPH. Los pacientes con CTEPH habían desregulado notablemente subpoblaciones de células inmunes. Hubo un aumento en los linfocitos T de 60.59 ± 9.94% a 69.05 ± 4.90% (P <0.0001) en pacientes con CTEPH. Los monocitos clásicos disminuyeron (87.94 ± 9.93% vs. 82.02 ± 9.92%, P <0.0001), mientras que los monocitos no clásicos aumentaron (3.69 ± 5.42% vs. 8.44 ± 5.91%, P = 0.02) en pacientes con CTEPH. La misma tendencia también se observó en el grupo de pH. Las células inmunes desreguladas se localizaron principalmente en las regiones de trombos y neointima. Los agregados de monocitos de plaquetas (PMA) y sus subpoblaciones se correlacionaron positivamente con los indicadores hemodinámicos y de ultrasonido. Los pacientes con PTE tenían mayores niveles de PMA que los pacientes con CTEPH (P = 0.0007), y estos niveles disminuyeron durante el tratamiento (P = 0.0168).
Conclusión
Las subpoblaciones de células inmunes en CTEPH se pueden analizar de manera eficiente utilizando el enfoque de citometría de flujo de volumen sanguíneo bajo. La desregulación de las células inmunes de sangre periférica apunta a una respuesta inmune activa en CTEPH. Las ideas sobre la fisiopatología de CTEPH se pueden obtener utilizando PMA como biomarcador para evaluar la gravedad y los resultados del tratamiento de CTEPH. Sin embargo, se necesita más investigación para determinar el papel de PMA en la CTEPH para la evaluación del diagnóstico de enfermedades y la patogénesis.
Introducción
La hipertensión pulmonar tromboembólica crónica (CTEPH), una condición vascular pulmonar peligrosa, es un resultado inusual del tromboembolismo pulmonar (PTE) (1). La resolución de trombos incompleto después de PTE causa la organización del trombo, que aumenta la resistencia y la remodelación vascular pulmonar y eventualmente da como resultado insuficiencia cardíaca derecha e hipertensión pulmonar persistente incluso con tratamiento anticoagulante ((2). Afectando el 2.7% de los sobrevivientes de PTE (3), una comprensión integral de la patobiología de CTEPH es de suma importancia.
Una vez que ocurre la obstrucción mecánica causada por el PTE agudo, inmediatamente establece una serie de reacciones fisiológicas, con una respuesta inflamatoria que emerge rápidamente (4). Específicamente, el daño inducido por la embolia a las células endoteliales vasculares pulmonar causadas por la embolia desencadena la liberación de citocinas y quimiocinas, que atraen células inmunes como linfocitos y macrófagos (((5). La presencia continua de estas células inmunes alimenta la inflamación prolongada, impulsando así el proceso de remodelación vascular (6, 7). Al mismo tiempo, la angiogénesis anormal en las áreas pulmonares afectadas interrumpe la vasculatura, impede el flujo sanguíneo y exacerbe la hipertensión pulmonar (8).
Investigaciones recientes han reconocido cada vez más el papel central del sistema inmune y la inflamación en CTEPH (9, 10). La endarterectomía pulmonar (guisante), un tratamiento curativo para CTEPH (11), revela respuestas inmunes locales en áreas de trombo (10, 12). Mientras que la sangre periférica puede reflejar el estado inmune sistémico (13, 14) y tiene potencial como biomarcador (15,16,17), no está claro si los cambios inmunes sistémicos impulsan la formación de trombos crónicos en CTEPH. Dado el papel fundamental de las células inmunes en el desarrollo de CTEPH, se necesita un método mínimamente invasivo para evaluar la función inmune utilizando pequeños volúmenes de sangre. Esto podría ayudar a identificar biomarcadores asociados con la gravedad de la enfermedad y descubrir mecanismos subyacentes, allanando el camino para nuevos objetivos terapéuticos.
Para abordar estas brechas de conocimiento, desarrollamos un enfoque de citometría de flujo de 7 colores que requiere solo 200 µl de sangre para analizar subconjuntos de células inmunes en pacientes con CTEPH. Nuestro estudio tiene como objetivo explorar la relación entre la desregulación inmune y la progresión de la enfermedad, e identificar biomarcadores para ayudar en la evaluación del riesgo de enfermedad y la evaluación del tratamiento.
Materiales y métodos
Participantes humanos
El Departamento de Medicina Pulmonar y de Cuidados Críticos del Hospital de Amistad China-Japan proporcionó pacientes con CTEPH para este estudio, mientras que el Centro de Examen Físico proporcionó controles saludables. Como controles, se eligieron personas sanas de la misma edad y sexo que estaban libres de otras enfermedades. Se adquirieron un permiso informado firmado y la aprobación ética (2022-KY-085). En noviembre de 2023, se recolectaron 36 individuos normales, y los pacientes con CTEPH fueron reclutados continuamente desde agosto de 2023 hasta junio de 2024 para el análisis de citometría de flujo sanguíneo completo. Se tomó 5 ml de sangre periférica anticoagulante de citrato de sodio de la vena radial del sujeto.
El grupo CTEPH incluyó pacientes recién diagnosticados y aquellos que se habían sometido a una cirugía de angioplastia pulmonar global (BPA). 14 pacientes fueron diagnosticados por primera vez y 48 pacientes recibieron tratamiento con BPA. El diagnóstico siguió las pautas europeas de 2022 para la hipertensión pulmonar (1, 18). En nuestro estudio, excluimos a los pacientes con CTEPH que tenían enfermedades autoinmunes o inflamatorias. Ninguno de los pacientes incluidos con CTEPH fue tratado con prostanoides. Además, la hipertensión pulmonar se clasifica en cinco clases distintas: hipertensión arterial pulmonar (HAP), hipertensión pulmonar secundaria a las enfermedades del corazón izquierdo, hipertensión pulmonar asociada con enfermedades pulmonares y/o hipoxia, CTEPH e hipertensión pulmonar de etiologías no claras y multifactoriales. En el contexto de este artículo, definimos específicamente el grupo de pH como los diagnosticados con cualquiera de los cuatro tipos de hipertensión pulmonar, excluyendo CTEPH y 10 pacientes con pH se incluyeron la población de estudio. También incluimos 20 pacientes con PTE agudos como controles en el Departamento de Emergencias del Hospital de Amistad Japón de China para CTEPH para aclarar las diferencias entre la trombosis aguda y la trombosis crónica.
Recolectando muestras de sangre entera para citometría de flujo
Para garantizar la especificidad de unión al antígeno -anticuerpo, se utilizó un agente de bloqueo humano para FCR (130-059–901, Miltenyi, Alemania). Se realizaron mezclas de anticuerpos en los volúmenes indicados en la tabla suplementaria 1 en 5 ml de tubos de flujo (352052–1, Corning, EE. UU.). La sangre completa (200 μl) se tiñó con la solución de anticuerpos después del bloqueo de FCR, y luego se mantuvo en la oscuridad durante 15 minutos. Después de agregar tampón de lisis de glóbulos rojos (CAT.00–4300-54, Ebioscience, EE. UU.), La combinación se mantuvo en la oscuridad durante otros quince minutos. Para el análisis de citometría de flujo (Beckman, Cytoflex), las muestras se resuspendieron en 200 μl de PBS después de centrifugar a 450 g durante cinco minutos y se lavaron dos veces con PBS.
Compilación de datos con software Flowjotm10
Se usó software llamado FlowJOTM10 (Flowjo LLC, EE. UU.) Para analizar los datos. Una estrategia de activación correcta identificó células no fragmentadas, solteras, vivas y positivas para CD45 como la puerta parental. Los recuentos de células dentro de esta puerta se usaron para calcular las células totales por muestra. Los recuentos de subpoblación de leucocitos se determinaron en función de la expresión de la etiqueta CD y el esquema de activación. Los porcentajes de todas las células individuales no fragmentadas que son positivas para CD45 se usaron para calcular las proporciones de la subpoblación. Los subgrupos positivos para CD41 dentro de cada tipo de célula inmune se identificaron como agregados de células inmunes de plaquetas.
Recolectar y preparar muestras
El bypass cardiopulmonar y la eliminación de la muestra se realizaron durante la cirugía de guisantes en el Hospital de Amistad China-Japan cuando el paciente estaba en hipotermia profunda y experimentaba un paro circulatorio. El material fibro-trombótico («trombo») de las porciones principales/de hoja y segmento/subsegmento se colocó en solución salina tamponada con fosfato (DPB) en hielo y se transportó para su procesamiento. El material de segmento/subsegmento se integró en parafina o congelado (Fig. 4A).
Inmunofluorescencia
Para localizar los linfocitos T (células T) y las subpoblaciones en el tejido de guisante, las secciones de parafina (n = 7) se tiñeron con DAPI (azul), CD3 (rojo), CD4 (verde) y CD8 (rosa). Los monocitos se tiñeron con CD14 (rojo), CD16 (verde) y colocalización de plaquetas con CD41 (rosa). La localización de granulocitos se evaluó con mieloperoxidasa (MPO) (rojo). Las células CD3+DAPI+, las células CD3+CD4+DAPI+y las células CD3+CD8+DAPI+fueron los tres tipos de células T. Los monocitos clásicos fueron CD14 ++ CD16LOWDAPI+, los monocitos no clásicos fueron CD14LOWCD16 ++ DAPI+, y los monocitos intermedios fueron CD14+CD16+DAPI+. Los granulocitos fueron MPO+ y DAPI+. Las células del músculo liso se identificaron por α-SMA (verde) y células endoteliales por CD31 (rojo). Se seleccionaron secciones consecutivas para la inmunofluorescencia.
Evaluaciones clínicas
La demografía, el recuento sanguíneo completo (CBC), el historial clínico, la antropometría, el NT-proBNP y los datos de ultrasonido se recopilaron en el hospital. También se recopiló información hemodinámica obtenida del catéter cardíaco derecho para todos los participantes.
Análisis estadístico
SPSS 25 y Prism 7.0 (GraphPad) se usaron para analizar los datos. La tasa de descubrimiento falso (FDR) se aplicó al control para múltiples pruebas estadísticas. La media ± error estándar se usa para presentar los resultados. Para los datos normalmente distribuidos, los grupos se compararon utilizando pruebas t de muestra pareadas para datos pareados y pruebas t de muestra independientes para datos no apareados. Al comparar más de dos grupos con datos normalmente distribuidos, se usó la prueba ANOVA y cuando se requirió un análisis post hoc, se utilizó la prueba de Tukey. A…
(Tagstotranslate) Hipertensión pulmonar tromboembólica crónica (T) Citometría de flujo (T) Célula inmune (T) Agregado de monocitos de plaquetas (T) Severidad de la enfermedad (T) Pneumología (T) Sistema de neumología/respiratorio
