Combinación de secuenciación de ARN de una sola célula de células mononucleares de sangre periférica y transcriptoma exosomal para revelar los perfiles celulares y genéticos en la EPOC

Resumen

Fondo

Ha sido un consenso de larga data que las reacciones inmunitarias median principalmente la patología de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y que los exosomas pueden participar en la regulación inmunitaria en la EPOC. Sin embargo, la relación entre los exosomas y el estado inmunitario periférico en pacientes con EPOC sigue sin estar clara.

Métodos

En este estudio, secuenciamos exosomas de plasma y realizamos secuenciación de ARN unicelular en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con EPOC y controles sanos. Finalmente, construimos redes de interacción proteína-proteína (PPI) y ARN endógeno competitivo (ARNce) para delinear las interacciones entre las PBMC y los exosomas dentro de la EPOC.

Resultados

Identificamos 135 mRNA, 132 lncRNA y 359 circRNA de exosomas que se expresaron diferencialmente en seis pacientes con EPOC en comparación con cuatro controles sanos. Los análisis de enriquecimiento funcional revelaron que muchos de estos ARN expresados ​​diferencialmente estaban involucrados en las respuestas inmunitarias, incluida la defensa de la infección viral y la interacción citoquina-receptor de citoquina. También identificamos 18 grupos de células distintas de PBMC en un paciente y un control mediante el uso de un análisis de grupos no supervisado llamado proyección y aproximación de colector uniforme (UMAP). De acuerdo con la identificación celular resultante, era probable que las proporciones de monocitos, células dendríticas y células asesinas naturales aumentaran en el paciente con EPOC que probamos, mientras que las proporciones de células B, células T CD4 + y células T CD8 + vírgenes disminuyeron. En particular, los niveles de células CD8+ T efectoras de memoria CD45RA+ (Temra) y CD8+ de memoria T efectoras (Tem) estaban elevados en pacientes con EPOC, que se caracterizaban por su menor capacidad de diferenciación debido a su estado de diferenciación terminal y menor capacidad reactiva a patógenos virales.

Conclusiones

Generamos un perfil de ARN exosomal y un perfil transcriptómico unicelular de PBMC en la EPOC, describimos la posible conexión entre la función inmunitaria alterada y el desarrollo de la EPOC, y finalmente determinamos el posible papel de los exosomas en la mediación de las reacciones inmunitarias locales y sistémicas.

Fondo

A medida que la tasa de envejecimiento demográfico y urbanización continúa aumentando, las enfermedades respiratorias crónicas imponen cargas económicas y de salud cada vez mayores a todas las naciones. [1]. Una revisión sistemática informó que la prevalencia mundial de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) fue del 10,3 % en 2019 según la definición GOLD, afectando a 391,9 millones de personas [2]. Las muertes por EPOC representaron el 5,7% de todas las muertes en 2017 [1]. China, como el país más poblado, representa la mayor parte de la carga mundial de la EPOC. Según una muestra representativa a nivel nacional, la prevalencia estimada de la EPOC en China fue del 13,6 %, y la EPOC fue la quinta causa de muerte en todo el país en 2016 [3]. Sin embargo, la mayoría de los tratamientos existentes para la EPOC tienen como objetivo aliviar los síntomas y evitar la exacerbación aguda. Todavía faltan intervenciones más específicas, en parte porque la patogenia de esta enfermedad no está bien establecida. Por lo tanto, aclarar la fisiopatología de la EPOC es un enfoque importante en el campo de las enfermedades respiratorias.

Los pacientes con EPOC sufren una limitación constante de las vías respiratorias, que es causada predominantemente por la inflamación de las vías respiratorias y se caracteriza por una mayor liberación de factores proinflamatorios y recuentos más altos de células inmunitarias. [4]. La EPOC en sí misma es una enfermedad muy heterogénea de orígenes complejos y diversos. En lugar de la inflamación crónica estimulada por el tabaco en individuos genéticamente susceptibles, la EPOC se ha reconocido recientemente como una acumulación de interacciones de exposición genética acompañada de envejecimiento [5].

Las características del sistema inmunitario periférico siguen siendo esquivas, por lo que las propiedades reguladoras de las reacciones inmunitarias en la EPOC merecen más estudios. Se han hecho esfuerzos para identificar los distintos endotipos inflamatorios subyacentes a la EPOC en base a biomarcadores de esputo y sangre. [6]. Además, se ha demostrado que los biomarcadores locales y periféricos, especialmente los biomarcadores relacionados con la inmunidad, se asocian con los fenotipos de la EPOC a nivel celular y molecular. La capacidad de los transcriptomas sanguíneos para predecir el desarrollo y la progresión de la EPOC [7] también se ha ilustrado, y varias firmas de expresión génica estimuladas por interferones se han asociado con rasgos clínicos de la EPOC [8]. Las firmas de expresión génica de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), representativas de la función inmunitaria sistémica, han sido validadas para desempeñar funciones críticas en la patogenia de la EPOC [9]. No obstante, el mecanismo por el cual se regula el sistema inmunitario durante la progresión de la EPOC sigue siendo desconocido. La evidencia ha demostrado que la activación de las reacciones inmunitarias se basa en mediadores intercelulares, incluidos los exosomas. [10]. Derivados de macrófagos residentes en los pulmones o de células epiteliales bronquiales, los exosomas pueden inducir la producción de citocinas y otras moléculas de transducción de señales que activan el reclutamiento de células inmunitarias aguas abajo y otras reacciones inflamatorias. [11].

A pesar de los grandes avances en nuestro conocimiento de la EPOC, la relación entre la inflamación local de las vías respiratorias y el estado inmunitario periférico sigue sin estar clara. Teniendo en cuenta la sólida evidencia con respecto a la asociación entre los exosomas, las células inmunitarias y la fisiopatología de la EPOC, nuestro objetivo fue determinar la conexión entre los exosomas y los patrones inmunitarios periféricos en la EPOC. Para ilustrar el panorama inmunológico de las PBMC en la EPOC, realizamos una secuenciación profunda de ARN unicelular (ARNc). Al visualizar las interacciones proteína-proteína entre el ARN exosomal y las PBMC, intentamos identificar posibles firmas de ARN exosomal de la transducción de señalización relacionada con la inflamación y explorar los posibles roles de las células inmunitarias en la patología de la EPOC, arrojando luz sobre los mecanismos subyacentes a las funciones inmunitarias deterioradas en pacientes con EPOC.

Métodos

Colección de especímenes humanos

Los pacientes con EPOC que fueron hospitalizados en el Hospital de la Universidad de Hong Kong-Shenzhen sirvieron como grupo de enfermedad (n = 6), mientras que los voluntarios sanos sirvieron como grupo de control (n = 4). Se recogieron dos muestras de sangre por participante para el aislamiento de exosomas y la preparación de PBMC respectivamente e información clínica en su primer día de hospitalización. Las características de referencia de todos los participantes se proporcionan en la Tabla 1. Se usó una muestra de sangre de cada participante para la secuenciación del ARN exosómico, cuyos datos se fusionaron en una matriz de expresión de ARN ordenada por grupo. Se seleccionaron dos sujetos sin complicaciones, Dis6 del grupo de enfermedad y Con4 del grupo de control para la secuenciación del ARN unicelular de PBMC.

Tabla 1 Características basales de los sujetos incluidos

Aislamiento de exosomas

Las muestras de sangre anticoaguladas con ácido etilendiaminotetraacético se centrifugaron a 10.000 ×gramo durante 15 min a 4 ° C para eliminar los residuos. Los sobrenadantes se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se trataron con proteinasa K (Life Technologies, MD, EE. UU.) durante 10 min a 37 °C. Se añadió reactivo de aislamiento de exosomas totales (Invitrogen, Gaithersburg, MD, EE. UU.) a los tubos y se incubaron durante 30 min a 4 °C. Posteriormente, los exosomas se retuvieron en el sedimento mediante centrifugación a 10.000 ×gramo durante 5 min a 4 °C. Después de centrifugar en las mismas condiciones durante 1 min, se eliminaron los sobrenadantes y los exosomas se incubaron en 110 μL de PBS durante 3 min a 37 °C. El precipitado de exosomas se resuspendió para experimentos posteriores.

Caracterización de exosomas

Se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) (HT-7800, Hitachi High-Technologies Corporation, Minato, Tokio, Japón) para examinar la morfología de los exosomas aislados. Primero, se diluyeron 5 μL de los exosomas aislados con PBS hasta un volumen de 10 μL antes del examen. Luego, las muestras se dejaron caer sobre una malla de cobre durante 1 minuto y el exceso de suspensión se eliminó con papel de filtro. Posteriormente, se añadieron 10 μL de acetato de uranilo al 2% al depositado…

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