Resumen
Antecedentes
El derrame pleural maligno (MPE) es una complicación grave en el cáncer de pulmón, caracterizado por un microambiente tumoral inmunosupresor (TME) y opciones terapéuticas limitadas. Este estudio investiga el papel de IL-6 en la regulación de la supresión inmune y la progresión tumoral en MPE y evalúa la eficacia del bloqueo Dual IL-6 y PD-L1.
Métodos
Los niveles de IL-6 se midieron en MPE y muestras de suero emparejadas de pacientes con cáncer de pulmón, y las correlaciones con la expresión de PD-L1 y los resultados clínicos se analizaron utilizando conjuntos de datos disponibles públicamente. La secuenciación de ARN y la desconvolución inmune se usaron para evaluar la infiltración de células inmunes. Los CAF y la infiltración de células inmunes se evaluaron adicionalmente utilizando citometría de flujo, inmunohistoquímica e inmunofluorescencia multiplex. Se emplearon sistemas de cocultivo in vitro para simular el microambiente MPE y explorar las interacciones IL-6 con CAF, así como su efecto regulador sobre la expresión de células Tumorales PD-L1.
Resultados
Los niveles de IL-6 se elevaron significativamente en MPE en comparación con el suero emparejado y se correlacionaron con una mayor expresión de PD-L1 y malos resultados de supervivencia en pacientes con cáncer de pulmón. En el modelo de ratón MPE, la terapia de combinación con el bloqueo IL-6 y PD-L1 redujo el volumen de MPE, la carga tumoral y la expresión de PD-L1, al tiempo que mejora la infiltración de células T y alivia la inmunosupresión de TME. Se descubrió que IL-6 conduce un circuito de retroalimentación positivo con ICAFS, promoviendo un entorno inmunosupresor. In vitro, IL-6 de la célula tumoral ascendente de MPE expresa la vía IL-6/STAT3.
Conclusión
Este estudio identifica IL-6 como un contribuyente crítico de la supresión inmune y la progresión tumoral en MPE. La combinación del bloqueo de IL-6 y PD-L1 alivió efectivamente la inmunosupresión y redujo la carga tumoral, que ofrece un enfoque terapéutico potencial para el manejo de MPE.
Introducción
El derrame pleural maligno (MPE), una complicación grave en el cáncer, es causado predominantemente por tumores metastásicos como el cáncer de pulmón (1), lo que conduce a un mal pronóstico con una supervivencia media de menos de un año (2). A pesar de los avances en las terapias contra el cáncer, los tratamientos actuales para MPE permanecen en gran medida paliativos (3). MPE surge de varios factores, incluido el drenaje linfático de la interrupción, aumento de la permeabilidad capilar y pleural, producción elevada de líquidos (4). Esto da como resultado la acumulación de derrame exudativo rico en tumor y células inmunes (5), que fomenta un microambiente pro-tumorigénico e inmunosupresor con hipoxia y evasión inmune (6). Los avances recientes en el bloqueo de punto de control inmune (ICB) han mostrado beneficios significativos (7, 8). Sin embargo, la resistencia sigue siendo un desafío crítico (9), particularmente en MPE y otros tumores «fríos», que subraya la necesidad de nuevas estrategias terapéuticas (10).
La interleucina-6 (IL-6) como una citocina prevalente en el microambiente tumoral (TME) de MPE se ha implicado en la progresión tumoral y la supresión de las respuestas inmunes ((11). Los niveles elevados de IL-6 se observan con frecuencia en varios tipos de cáncer, incluido el cáncer de pulmón, donde promueve la progresión tumoral a través de la vía de señalización IL-6/STAT3 (12, 13). Es producido por macrófagos asociados a tumores (TAM), células tumorales, fibroblastos asociados al cáncer (CAF), células T CD4+, células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) y otras células (((12, 14, 15). Una fuente importante de IL-6 en MPE son las células mesoteliales pleurales (PMC) (16), que puede hacer la transición a miofibroblastos a través de la transición mesotelial a mesenquima (MMT) (17, 18). Estas células contribuyen al microambiente inmunosupresor y facilitan la evasión inmune de las células tumorales en parte a través de la regulación positiva de los puntos de control inmunes (13). Estudios preclínicos recientes han demostrado que la inhibición de IL-6 combinada con el bloqueo de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1)/proteína de muerte celular programada 1 ligando 1 (PD-L1) tiene el potencial de mejorar el control tumoral. Sin embargo, su interacción potencial y su impacto combinado en MPE siguen sin estar claros (19,20,21,22,23).
Los CAF son un componente crítico del TME y se reconocen cada vez más por su heterogeneidad funcional (24,25,26). Los subtipos de CAF distintos, como los CAF inflamatorios (ICAF) y los CAF miofibroblásticos (MYCAF), exhiben roles divergentes en la progresión tumoral (27). Existe un debate en curso sobre el papel de MyCAFS, con evidencia contradictoria sobre efectos pro-tumorigénicos o supresores en diferentes tumores (28,29,30). Teniendo en cuenta que MyCAFS e ICAFS son conocidos por sus capacidades de interconversión influenciadas por señales derivadas de tumores (31), dirigirse a moléculas y vías de señalización específicas en lugar del subtipo CAF específico puede ser una estrategia terapéutica más viable (32). A pesar de las diferencias entre los tipos de cáncer, la señalización del receptor IL-6/IL-6 (IL-6R) emerge como un sello distintivo pro-tumorigénico consistente de las ICAF (32). Estos CAF generalmente se asocian con un entorno inmunosupresor debido a la alta expresión de citocinas y la baja producción de matriz extracelular (ECM) (ECM) (ECM) (ECM) (ECM)33) representan un objetivo crítico para mejorar la terapia ICB (34). Por lo tanto, se espera que las terapias anti-IL-6 como el tocilizumab se dirigen a estos CAF y sean terapéuticamente beneficiosas (15, 35,36,37). Sin embargo, el papel de los CAF en el TME, particularmente en MPE, permanece subexplorado.
Este estudio tiene como objetivo abordar estas brechas investigando el potencial terapéutico del bloqueo dual de IL-6 y PD-L1 en MPE. Analizamos de manera integral los efectos de esta terapia combinada en el TME, con un enfoque particular en su impacto en los subtipos de CAF y la vía de señalización IL-6/STAT3. Nuestros hallazgos proporcionan información crítica sobre la interacción molecular dentro del microambiente MPE y resaltan el potencial terapéutico de dirigirse tanto a IL-6 como a PD-L1.
Materiales y métodos
Células y cultivo celular
El carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) y las células de los Institutos Nacionales de Salud (NIH)/3T3 fueron suministradas por el Banco de Células de la Academia de Ciencias de Shanghai (Shanghai, China). La LLC-Luciferasa (LUC) se generó a partir de LLC transfectada de manera estable con un lentivirus que lleva el vector de luciferasa (GV260, Genechem, Shanghai, China) y seleccionado por 4 µg/ml de puromicina (Beyotime, Shangghai, China). Las células LLC, NIH/3T3 y LLC-LUC se cultivaron en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco, EE. UU.) Con suero bovino fetal al 10% (FBS, Gibco, EE. UU.). Las células NSCLC humanas (A549) ofrecidas por el Banco de Ciencias de Shanghai Cell Bank of Chinese se cultivaron en el F-12K de Ham (F-12k, Meilunbio, Dalian, China) con 10% de FBS. Después de ser autenticado por el análisis de repeticiones en tándem cortas, las líneas celulares LLC y A549 se probaron negativas para la contaminación de micoplasma en los últimos seis meses y se utilizaron en los números de pasaje <10.
Se extrajeron CAF de pulmón primarios y fibroblastos normales (NF) de tejidos de cáncer de pulmón y contraparte tejidos pulmonares normales, que fueron adquiridos de dos pacientes diagnosticados con cáncer de pulmón en esta institución. Los tejidos se picaron y se digirieron con 1 mg/ml de colagenasa tipo IV (C5138, Sigma-Aldrich, EE. UU.) A 37 ℃ durante 1 h para aislar CAF y NFS. Obtenido con el consentimiento informado adecuado de los pacientes, todas las muestras obtuvieron la aprobación del Comité Ético y la Junta de Revisión Institucional del Hospital Jinling. El cultivo de CAFS y NFS se completó con DMEM/Mezcla de Nutrientes F-12 (DMEM/F-12, Gibco, EE. UU.) Continiendo 10% -20% de FBS.
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se separaron de 10 ml de sangre periférica obtenida de donantes sanos con consentimiento informado. La sangre recolectada se diluyó con un volumen equivalente de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y recibió una centrifugación de 15 minutos con centrifugación de gradiente de densidad Ficoll (Solarbio, Beijing, China) en un tubo de aislamiento PBMC de SepMate (Stemcell, EE. UU.) A 400 g a temperatura ambiente. Se empleó una solución de lisis de glóbulos rojos (RBC) (Biolegend, EE. UU.) Para los glóbulos rojos residuales de Lyse, y las PBMC se enjuagaron dos veces con PBS. Posteriormente, estas células se contaron y se usaron inmediatamente para el cocultivo indirecto con CAF en una relación de 5: 1 con un sistema Transwell (Labelect, Hefei, China). Los CAF se presentaban en suero durante 12 h antes del tratamiento.
Todo el medio de cultivo celular se complementó con estreptomicina de penicilina (100 U/ml) (100 mg/ml). Todas las células se mantuvieron a 37 ℃ en una atmósfera humidificada con dióxido de carbono al 5% (CO2). Para condiciones in vitro, se usaron los siguientes reactivos: proteína IL-6 humana recombinante (206-IL-010, R&D Systems, EE. UU.), S3I-201 (S1155, Selleck Chemicals, EE. UU.) Y Tocilizumab (Roche, Suiza).
Modelos de ratones y MPE
Los ratones machos C57BL/6J de seis semanas fueron comprados en el modelo de investigación de animales de la Universidad de Nanjing (Nanjing, China). El modelo de ratón MPE se preparó mediante una inyección intrapleural de células 5 × 105 LLC o LLC-LUC (8) (Figuras complementarias 1A-C). Los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos: vehículo, anticuerpo monoclonal anti-IL-6 (MAB), anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 (MAB), así como grupos anti-IL-6 MAB y anti-PD-L1 MAB. Mice were intrapleurally injected with 200 μg anti-PD-L1 mAb (Clone:10F.9G20, BE0101, BioXcell, USA) and/or anti-IL-6 mAb (Clone: MP5-20F3, BE0046, BioXcell, USA) or IgG2b isotype control (Clone: LTF-2, BE0090, BioXcell, USA) on the Días 7 y 14 del modelo, siguientes dosis utilizadas en estudios anteriores (19,20,21) y en nuestros experimentos de optimización anteriores en modelos MPE (8). Para el modelo MPE inyectado con células LLC-LUC, la observación de ratones se realizó mediante imágenes de bioluminiscencia en los días 7 y 14 antes de la inyección intrapleural y el día 21 antes de la escarificación. Las muestras de MPE y los nódulos tumorales se recogieron y se midieron el día 21. El estado de supervivencia de los ratones MPE se observó todos los días hasta un resultado fatal para todos los ratones.
Para evaluar la función de los CAF, los ratones se inyectaron intrapleuralmente con células 5 × 105 LLC/LLC-LUC solamente o 5 × 105 LLC/LLC-LUC y células 1 × 106 NIH/3T3 (35). Investigar los efectos sinérgicos del inhibidor de IL-6 y …
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