Resumen
Objetivo
La autofagia desregulada juega un papel crítico en la patogénesis de la fibrosis pulmonar. La proteína de estrés Trib3 se ha correlacionado con la autofagia anormal, pero su contribución específica a la fibrosis pulmonar inducida por radiación (RIPF) sigue sin estar clara. Este estudio tuvo como objetivo dilucidar el papel de Trib3 en la progresión de RIPF.
Métodos
Realizamos la secuenciación de ARN del tejido pulmonar RIP de rata para analizar el perfil transcriptómico y determinar los cambios de expresión génica en murino con RIPF. Establecimos modelos de ratón con células epiteliales alveolares tipo II (AEC II) eliminando o sobreexpresión de Trib3 para dilucidar su papel en la progresión de RIPF. Utilizamos células reporteras fluorescentes MRFP-GFP-LC3, análisis de seguimiento de nanopartículas, ensayos de inmunofluorescencia e inmunoprecipitación para descubrir los mecanismos subyacentes.
Resultados
La expresión de Trib3 se elevó en AEC II irradiado. Silenciar Trib3 en AEC II mitigó RIPF en ratones, mientras que su sobreexpresión exacerbó la condición. Mecánicamente, Trib3 interactuó con el motivo de la región de interacción LC3 (LIR) y el dominio asociado a ubiquitina (UBA) del secuestos 1 (SQSTM1), una proteína del receptor autofágico, inhibiendo así el flujo autofágico en la línea celular AEC II MLE12. Esta inhibición aumentó la secreción del exosoma y facilitó la diafonía entre las células MLE12 y los fibroblastos, mejorando en última instancia la proliferación y la producción de matriz extracelular de fibroblastos pulmonares.
Conclusión
Trib3 en AEC II inhibe el flujo autofágico al interactuar con SQSTM1, aumentando así la secreción del exosoma, lo que promueve la proliferación de fibroblastos y la producción de matriz extracelular, que contribuye a la progresión de RIPF.
Introducción
Fibrosis pulmonar inducida por radiación (RIPF), que ocurre en el 16–28% de los casos de radioterapia torácica (1), es una complicación tardía caracterizada por la activación de fibroblastos, la deposición excesiva de ECM y la disfunción pulmonar progresiva (2). Como las intervenciones terapéuticas actuales demuestran una eficacia limitada en el manejo de RIPF, enfatizando la necesidad de comprender mejor su patogénesis y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas.
La autofagia, una vía de degradación intracelular conservada evolutivamente, es esencial para mantener la homeostasis intracelular (3) y regula críticamente la progresión de la fibrosis pulmonar. En la fibrosis pulmonar idiopática (IPF), modula la apoptosis de fibroblastos y la senescencia epitelial (4), mientras que la disfunción CFTR en CF deteriora la autofagia epitelial (5). La fibrosis inducida por sílice se atenúa mediante la reducción de la apoptosis epitelial mediada por la autofagia (6). Sin embargo, la autofagia de macrófagos excesivos puede empeorar la silicosis activando fibroblastos (7). Estos roles duales destacan el potencial terapéutico de la autofagia para enfermedades pulmonares fibróticas (8).
Aunque RIPF comparte características patológicas similares con otras condiciones fibróticas pulmonares, su patogénesis es distinta (9). La radiación interrumpe la maquinaria autofágica (10, 11), sin embargo, el papel preciso de la autofagia en las respuestas celulares a la radiación sigue siendo poco clara y potencialmente dependiente del contexto. La evidencia sugiere que el tipo, el alcance y el momento del estrés son determinantes importantes del destino celular después de la inducción de la autofagia (12). Por lo tanto, el papel de la autofagia en el RIPF aún no está claro.
Estudios recientes han identificado Tribbles Homolog 3 (Trib3) como una pseudoquinasa sensible al estrés que está regulada en diversas enfermedades humanas y juega roles complejos específicos de tipo celular en la regulación de la autofagia y la patogénesis de la fibrosis pulmonar (13,14,15,16). En los hepatocitos, Trib3 inhibe el flujo autofágico al interrumpir la interacción SQSTM1/P62-LC3 (17), mientras que en las neuronas promueve la formación de autofagosomas a través de la activación de ULK1 a través de la inhibición de MTOR (18). En el contexto de IPF, Trib3 exhibe efectos diferenciales entre los tipos de células: perjudica la regeneración de células epiteliales alveolar (19), promueve la activación de macrófagos profibróticos (20), pero paradójicamente suprime la activación de fibroblastos (21). Un estudio reciente ha informado que tanto Trib3 como p62 están regulados al alza en fibroblastos activados y tejido pulmonar de ratones IPF (22). Estos hallazgos apuntan a Trib3 como un objetivo prometedor para IPF. Sin embargo, actualmente no hay estudios que informen sobre Trib3 en el contexto de RIPF.
En este estudio, examinamos la expresión de Trib3 en el tejido pulmonar fibrótico de los modelos murinos de RIPF y encontramos que Trib3 inhibió el flujo autofágico en AEC II y mejora la secreción del exosoma, facilitando así la progresión de RIPF. Nuestros hallazgos aclaran el papel de Trib3 en la patogénesis de RIPF y proporcionarán una referencia para futuras investigaciones sobre estrategias preventivas y terapéuticas para RIPF.
Materiales y métodos
Anticuerpos
Todos los anticuerpos primarios utilizados para el análisis de inmunotransferencia, inmunoprecipitación e inmunotinción en el presente estudio se enumeran de la siguiente manera: anti-Trib3 (B-2) (SC-390242), anti-SQSTM1 (D-3) (SC-28359) y anti-HA TAG (F-7) (SC-7392) de Santa Cruznología (TEXA); anticuerpo antifibronectina (AB45688) y anticuerpo anti-MMP2 (AB37150); Antibuerpos musculares α-suaves (A5228) y anti-Flag monoclonal (F-1804) de Sigma (Nueva Jersey, EE. UU.); Proteína C anti-prosurfactante (SPC) (3432601) de Millipore (California, EE. UU.); El anticuerpo policlonal SQSTM1 (18420-1-AP), el anticuerpo policlonal HA (51064-2-AP), IgG de ratón (B900620), el conejo IgG (B900610) y el anticuerpo monoclonal GAPDH (60004-1-IG) de Proteintech (Wuhan, China).
Reactivos
El tampón de lisis IP Pierce ™ (87787), las perlas magnéticas de proteína Pierce ™ A/G (88803) y Supersignal ™ West Pico más sustancia quimioluminiscente (34577) se adquirieron de ThermoFisher Scientific (Massachusetts, EE. UU.). La hidroxicloroquina (HY-W031727) se adquirió de MCE (Nueva Jersey, EE. UU.). El kit de ensayo de contenido de RIPA Lysis (R0020), hidroxiprolina (HYP) (BC0225) y el kit de tinción de tricromo de Masson (G1340) se adquirieron de Solarbio (Beijing, China). El reactivo Lipofectamine® Rnaimax (13788-150) y el reactivo Lipofectamine ™ 3000 (L3000015) se adquirieron de Invitrogen (California, EE. UU.). El kit cuantitativo de BCA (P0010) se adquirió de Beyotime Biotechnology (Shanghai, China). El ensayo de proliferación celular EDU (C10310-1) se adquirió de Ribobio (Guangzhou, China).
Establecimiento del modelo Murine RIPF
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética y de bienestar animal del Instituto de Medicina de Radiación de Peking Union Medical College (IRM-DWLL-2021132). Los animales fueron alojados en el Instituto de Medicina de Radiación, Academia China de Ciencias Médicas y Colegio de Medicina de la Unión de Pekín, Tianjin, China. Todos los animales fueron adquiridos de Beijing Huafukang Biotechnology Incorporated Company (SCXK (Beijing) 2019-0008), y se mantuvieron en un entorno específico libre de patógenos.
Las ratas machos, de 4 a 6 semanas de edad y pesaban 180-200 g, se anestesiaron con tribromoetanol. Como se publicó anteriormente en nuestro estudio, la irradiación pulmonar derecha unilateral se administró utilizando un irradiador de rayos X RS-2000 (RAD Source Technologies, EE. UU.) A una tasa de dosis de 1.522 Gy/min para una dosis acumulativa de 17 Gy, RIPF desarrollado 4 meses después de la irradiación ((23). Las ratas fueron sacrificadas por inyección intraperitoneal de una sobredosis de pentobarbital (150 mg/kg).
El modelo de ratón RIPF se estableció después de parámetros optimizados derivados de estudios anteriores realizados por nuestros colaboradores institucionales (24). Específicamente, los ratones machos, de 4 a 6 semanas de edad y con un peso de 21 a 23 g, se anestesiaron con tribromoetanol e irradiados con 17 rayos X al pulmón derecho unilateral a una tasa de dosis de 2.7 Gy/min, RIPF desarrollado 6 meses después de la irradiación. Los ratones fueron sacrificados por decapitación.
Todos los animales fueron monitoreados de cerca para cambios en la respiración y el peso corporal después de la irradiación. La fibrosis pulmonar se confirmó mediante tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y tinción de tricromo de Masson.
Extracción de ARN y análisis bioinformático
El ARN total se extrajo de los tejidos pulmonares de ratas usando reactivo TRIZOL (Invitrogen, California, EE. UU.) De acuerdo con el protocolo del fabricante. La secuenciación de ARN fue realizada por Gene Denovo Biotechnology Co., Ltd (Guangzhou, China), y los datos se han depositado en la base de datos NCBI SRA con el número de acceso PRJNA1196531. El análisis de expresión diferencial de ARN (DEG) se realizó mediante DESEQ2 (25) Software entre grupos normales y rIPF. Las transcripciones con el parámetro de tasa de descubrimiento falso (FDR) por debajo de 0.05 y el cambio de pliegue absoluto ≥ 2 se consideraron transcripciones expresadas de manera diferencial. Entonces los DEG en todos o cada perfil fueron sometidos a ontología genética (GO) (26), Enciclopedia de Kyoto de genes y genomas (KEGG) Análisis de enriquecimiento de la vía (27) y análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (28).
Cultivo celular
La línea celular MLE12 (ATCC® CRL-2110 ™), derivada de células epiteliales de pulmón murmurales tipo II, se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC, Virginia, EE. UU.). The cells were cultured in Ham’s F12 medium (HyClone, Utah, USA) supplemented with 2% fetal bovine serum (FBS) (Gibco, New Zealand), 0.005 mg/mL insulin (M&C Gene, Beijing, China), 0.01 mg/mL transferrin (M&C Gene, Beijing, China), 10 nM β-estradiol (M&C Gene, Beijing, China) e hidrocortisona de 10 nM (Gene M&C, Beijing, China). Las células NIH/3T3 se adquirieron de ATCC y se cultivaron en DMEM (Hyclone, Utah, EE. UU.) Suplementado con FBS al 10%.
Administración intratraqueal
Después de la anestesia con tribromoetanol, el ratón se fijó en la placa operativa y la glotis se expuso con pinzas curvas. Se insertó un trocar de 20 g a lo largo de la glotis, y el núcleo se sacó después de que estaba en su lugar. Después de verificar la colocación del catéter, se inyectó 40 a 80 µl de virus adenoasociado utilizando una jeringa nebulizante. Después de la inyección, se retiró la jeringa, y la placa operativa se erigió durante 5 minutos para permitir que el medicamento se infiltrara en el pulmón inferior por la gravedad, y finalmente se retiró la cánula. Luego, los ratones se colocaron en ropa de cama y se calentaron con una lámpara para monitorear sus signos vitales, incluidos …
(Tagstotransilate) Radio-induce fibrosis pulmonar (T) Trib3 (T) Células epiteliales alveolares tipo II (AEC II) (T) Flujo autofágico (T) Sistema de neumología (T)/respiratorio Sistema respiratorio
