Análisis de la configuración celular de la hipertensión arterial pulmonar a través de estudios unicelulares ómicos


Resumen

Este análisis observa de qué manera las tecnologías ómicas unicelulares, en particular la secuenciación de ARN unicelular (scRNAseq), enriquecen nuestra comprensión de la hipertensión arterial pulmonar (HAP). La HAP es un trastorno polifacético caracterizado por una remodelación vascular pulmonar, que resulta en un elevado índice de morbilidad y mortalidad. La patobiología celular de esta enfermedad diversa, que abarca distintos tipos de células vasculares y no vasculares, no está totalmente comprendida. Las investigaciones tradicionales sobre HAP han enfrentado dificultades para abordar la complejidad de las poblaciones celulares patógenas. El scRNAseq brinda una perspectiva detallada al describir la diversidad celular dentro de la HAP, identificando subconjuntos de células, redes genéticas y vías moleculares exclusivas que impulsan la enfermedad. Se examinan descubrimientos destacados de la literatura reciente y se resume cómo el scRNAseq ha revolucionado nuestra comprensión de la HAP en modelos humanos, de ratas y de ratones. Este resumen resalta los conocimientos adquiridos sobre fenotipos celulares, patrones de expresión genética y nuevos objetivos moleculares, y considera los desafíos y posibles enfoques para la investigación. Se plantean formas en las que los enfoques unicelulares ómicos podrían orientar futuras investigaciones y esfuerzos traduccionales para contrarrestar la HAP.

Introducción

La secuenciación de ARN unicelular (scRNAseq) representa una transformación en nuestra capacidad para investigar el transcriptoma a un nivel detallado, desvelando la heterogeneidad celular de los tejidos saludables y enfermos. Este análisis ahonda en el impacto vanguardista de scRNAseq y su potencial para proporcionar comprensión sin precedentes sobre la patobiología de la hipertensión arterial pulmonar (HAP), un trastorno caracterizado por una remodelación vascular compleja que desencadena insuficiencia cardíaca derecha y alta mortalidad. En esta remodelación, las células vasculares, como las células endoteliales (CE), juegan un papel crucial al adoptar un fenotipo hiperproliferativo y resistente a la apoptosis. Además, la inflamación y la desregulación inmune también pueden impulsar la remodelación vascular en la HAP, con diversas células inmunes involucradas en la patogénesis de la enfermedad. La llegada de scRNAseq ha permitido un examen minucioso del panorama transcriptómico de la diversa gama de células vasculares e inmunes que podrían influir en la patobiología de la HAP. A pesar de la importancia de los enfoques moleculares tradicionales, estos ofrecen una visión limitada y, a menudo, silencian las complejas interacciones celulares y la heterogeneidad básica de la enfermedad. Este análisis destaca los avances recientes posibilitados por scRNAseq, ilustrando hallazgos claves en diversas poblaciones de células en modelos de HAP en sujetos humanos, ratas y ratones. Después de esta presentación, iniciaremos una discusión en torno a las consideraciones técnicas para configurar experimentos de scRNAseq. Nuestra revisión bibliográfica se enfocó en estudios publicados entre 2020 y 2024, reflejando los descubrimientos más recientes y relevantes en el campo. Resumimos conocimientos significativos, destacamos los desafíos abordados y sugerimos direcciones para investigaciones futuras en ómicas unicelulares que podrían impulsar el campo y avanzar en estrategias clínicas para la HAP. Los conjuntos de datos de scRNAseq que respaldan nuestra discusión se esquematizan en la Tabla 1 y la figura. 1. Nuestra revisión de la literatura se guió por palabras clave como «hipertensión arterial pulmonar», «ómica unicelular» y «secuenciación de ARN unicelular». Intencionadamente se excluyeron estudios que abordan subgrupos de hipertensión pulmonar (HP) distintos de la HAP del grupo 1 de la OMS, como la hipertensión pulmonar tromboembólica crónica (HPTEC), para mantener un enfoque claro en las diversas características patobiológicas de la HAP del Grupo 1 de la OMS, que constituye el tema central de nuestro análisis y discusión.

tabla 1 Resumen de conjuntos de datos de scRNAseq en PAH. Solo se incluyen conjuntos de datos recientemente generados para un estudio específico. Se excluyeron aquellos conjuntos de datos previamente publicados que fueron reinterpretados.mesa de tamaño completo 1Figura 1

Esquema resumido de los estudios de scRNAseq en PAH. Puntos de varios colores indican la especie en la que se centró el estudio: rojo = humano; azul = ratón; verde = rata. Hecho con BioRender.com. SuHx = Sugen-hipoxia; MCT = monocrotalina.

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Consideraciones técnicas para experimentos de scRNAseq.

Al diseñar un experimento de scRNAseq, es crucial elegir la plataforma adecuada en función de las necesidades de la investigación para optimizar el proceso. Las plataformas basadas en gotas, como 10x Genomics, sobresalen en la captura de células de alto rendimiento y son expertas en la detección de tipos raros de células, aunque suelen detectar un menor número de genes por célula. Por otro lado, los métodos basados en placas, como Smart-seq2, permiten la secuenciación completa de transcripciones, capturando más genes y proporcionando datos sobre transcripciones de baja abundancia o empalmadas de forma alternativa, aunque capturan menos células por muestra. La decisión de fijar las muestras antes de scRNAseq depende de diversos factores, como la naturaleza de las interrogantes de investigación, la logística de las muestras y el equilibrio entre la preservación del ARN y la calidad de los datos.1, 2). Las muestras frescas, sin las alteraciones químicas introducidas por los fijadores, son óptimas para extraer ARN de alta calidad. No obstante, en casos donde no es práctico procesar de inmediato la muestra, la fijación (usando métodos como metanol o paraformaldehído) puede ser necesaria. La determinación del número de células y la profundidad de la secuenciación debe basarse en la complejidad de la muestra y los objetivos del estudio. Las muestras más complejas generalmente demandan analizar un mayor número de células, y si bien las profundidades de secuenciación más bajas pueden revelar la dinámica de la población celular, los análisis de expresión más detallados requieren profundidades mayores (3). Se sugiere iniciar con un mínimo de 20,000 pares de lecturas por célula para las plataformas 10x Genomics Single Cell 3′ v3 y v4, aunque se recomiendan estudios piloto y una revisión de la literatura correspondiente para ajustar esta estimación.

Células endoteliales (arteria)

La disfunción de las células endoteliales (CE) es un aspecto crucial en la patogénesis de la HAP, ya que desencadena eventos que perturban la homeostasis vascular pulmonar y originan una remodelación patológica. Investigaciones recientes de scRNAseq han arrojado luz sobre la biología de las CE en la HAP. Saygin et al. (4) presentaron una vista inicial del transcriptoma EC del tejido pulmonar de HAP idiopática humana (HAPI) mediante scRNAseq. Aunque el tamaño reducido de la muestra (3 pulmones con HAP) limitó la robustez estadística para el gen diferencialmente expresado (DEG) y el análisis de la vía de la CE y otros grupos celulares, se empleó un método analítico innovador en este estudio, SCENIC (5), un enfoque computacional para reconstruir redes reguladoras de genes a partir de datos de scRNAseq que relaciona secuencias reguladoras en cis con la expresión de genes unicelulares para anticipar interacciones entre factores de transcripción (TF) y genes diana. Su análisis SCENIC en CE destacó a SOX18 como un fuerte candidato a ser un regulador del transcriptoma de CE de IPAH: codifica un TF conocido por regular la integridad de la barrera endotelial y el desarrollo de los vasos. Las CE se analizaron como un conjunto en este estudio. En un enfoque similar, un estudio de scRNAseq pulmonar realizado por Thomas et al. (6) en el modelo de ratón con hipoxia crónica (hipoxia de 4 semanas; n = 1/grupo) también analizó las CE como un conjunto, identificando un fenotipo migratorio y proliferativo en respuesta a la hipoxia, acorde con observaciones previas. Sin embargo, subdividir las CE de pulmón en arterias, venas o capilares de la circulación pulmonar o sistémica es un desafío al analizar las CE en scRNAseq. Un atlas íntegro de EC pulmonar (7) ya está disponible y distingue los diversos subtipos de EC. Los genes de interés pueden consultarse y visualizarse en su servidor web (http://www.lungendothelialcellatlas.com/) a través de gráficos UMAP (Proyección Uniforme y Aproximada de Vecindario) de humanos o ratones. Además, los conjuntos de datos de scRNAseq públicamente disponibles (Tabla 1) pueden reanalizarse y mapearse en un conjunto de datos de referencia como el Atlas de Células Pulmonares Humanas (HLCA) (8), que ha detallado las CE en 8 subpoblaciones. El paquete Seurat R o la aplicación web Azimuth (https://azimuth.hubmapconsortium.org/) puede transferir de manera rápida etiquetas de células de referencia a un conjunto de datos de consulta en alta resolución basándose en la similitud de los transcriptomas celulares (9

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