Alteración del interactoma bacteriano en la estabilidad clínica y exacerbaciones de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica.

Resumen

Razón fundamental

Nuestra comprensión de la disbiosis de las vías respiratorias en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) sigue siendo incompleta, lo que puede mejorarse al desentrañar la complejidad del interactoma microbiano.

Objetivos

Caracterizar las características reproducibles del interactoma bacteriano de las vías respiratorias en la EPOC en la estabilidad clínica y durante la exacerbación, y evaluar sus asociaciones con los fenotipos de la enfermedad.

Métodos

Realizamos un análisis de red de coocurrencia basado en conjuntos ponderados de 1742 microbiomas de esputo de conjuntos de datos de microbiomas nuevos y publicados, que comprenden dos estudios de casos y controles de EPOC estable versus control sano, dos estudios de estabilidad de la EPOC versus exacerbación y un estudio con exacerbación-recuperación. datos de series de tiempo.

Resultados

Los pacientes con EPOC tenían un grado reproduciblemente menor de interacciones bacterianas negativas, es decir, el número total de interacciones negativas como proporción del total de interacciones, en el microbioma de sus vías respiratorias en comparación con los controles sanos. Evaluación de la Haemophilus El interactoma mostró que las redes de interacción antagónicas de este patógeno establecido, en lugar de su abundancia, cambiaron consistentemente en la EPOC. El análisis dinámico del interactoma reveló interacciones antagonistas reducidas de manera reproducible, pero no pérdida de diversidad durante la exacerbación de la EPOC, que se recuperó después del tratamiento. En el análisis fenotípico, la agrupación de redes no supervisadas mostró que la pérdida de interacciones antagonistas se asoció con peores síntomas clínicos (disnea), peor función pulmonar, inflamación neutrofílica exagerada y mayor riesgo de exacerbación. Además, los exacerbadores frecuentes (≥ 2 exacerbaciones por año) redujeron significativamente las interacciones bacterianas antagonistas al tiempo que exhibieron cambios sutiles en la composición de la microbiota de sus vías respiratorias.

Conclusiones

La alteración del interactoma bacteriano caracterizada por interacciones antagónicas reducidas, en lugar de cambios en la abundancia o diversidad de patógenos, es una característica reproducible de la disbiosis de las vías respiratorias en la estabilidad clínica y las exacerbaciones de la EPOC, lo que sugiere que podemos apuntar al interactoma en lugar del patógeno solo para el tratamiento de la enfermedad.

Introducción

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es un desafío de salud mundial y ocupa la tercera causa de muerte a nivel mundial (1). Se caracteriza por inflamación persistente de las vías respiratorias, enfisema y obstrucción del flujo aéreo, con episodios de exacerbaciones que aceleran el progreso de la enfermedad.1).

Cada vez hay más evidencia que sugiere que la disbiosis de las vías respiratorias contribuye a la EPOC: las alteraciones del microbioma de las vías respiratorias humanas se correlacionan con la inmunología pulmonar, la frecuencia de las exacerbaciones y la mortalidad.2,3,4); y el agotamiento de la microbiota murina mitiga la inflamación pulmonar crónica (5). Sin embargo, el diseño de intervenciones para restaurar la microbiota sigue siendo difícil debido a la falta de una imagen clara de la disbiosis de la EPOC. Las características microbianas, incluidas las métricas de diversidad y los taxones diferencialmente abundantes identificados en estudios de microbioma anteriores, son muy inconsistentes, ya sea en la estabilidad clínica de la EPOC o durante la exacerbación (Tablas complementarias 12). Además, aunque las alteraciones en la diversidad alfa y la abundancia relativa de taxones dentro del proteobacterias, Firmicutesy Bacteroidetes se informan en la estabilidad de la EPOC, hay cambios menores en el microbioma de las vías respiratorias durante la exacerbación (6). Estas ambigüedades impulsan la necesidad de comprender la disbiosis de las vías respiratorias desde una perspectiva alternativa.

Los microbiomas asociados a los humanos son ecosistemas donde los microbios no existen aislados sino que forman redes de interacción complejas, conocidas como interactoma.7). Desentrañar las interacciones entre la microbiota intestinal y las especies patógenas ha promovido el éxito clínico del trasplante de microbiota fecal para el tratamiento de Clostridium difficile (8) y enfermedades inflamatorias del intestino (9). En comparación con la microbiota intestinal, la microbiota de las vías respiratorias es un órgano de baja biomasa, pero en el que diferentes especies bacterianas aún pueden ejercer interacciones potentes: derivadas de las vías respiratorias Rothia mucilaginosa mitiga Pseudomonas aeruginosa Inflamación inducida en un modelo epitelial alveolar tridimensional (10); y la aspiración episódica de comensales orales disminuyen efectivamente Neumonía por estreptococos susceptibilidad en ratones (11). Sin embargo, el papel de estas interacciones microbianas en la EPOC no se ha considerado en estudios previos de microbiomas que se centraron exclusivamente en métricas diferenciales de abundancia o diversidad.

Aquí presentamos un análisis de red a gran escala de microbiomas de esputo (norte = 1742) de 5 cohortes geográficamente diversas que incluyen datos transversales y longitudinales para explorar el papel del interactoma bacteriano de las vías respiratorias en la EPOC. Demostramos que el interactoma bacteriano se altera tanto en la estabilidad como en la exacerbación de la EPOC y está fuertemente asociado con el fenotipo de exacerbación, lo que amplía nuestro conocimiento actual sobre la disbiosis de la EPOC y arroja luz sobre el diseño terapéutico futuro.

Métodos

Una cohorte china prospectiva de pacientes y controles con EPOC

La cohorte EndAECOPD (Predicción basada en endotipos de exacerbaciones agudas en la EPOC) tuvo como objetivo identificar predisposiciones biológicas a las exacerbaciones de la EPOC en poblaciones chinas con un protocolo de estudio publicado anteriormente (12). Entre mayo de 2018 y enero de 2020, 165 pacientes con EPOC estable y sin antibióticos en los últimos dos meses fueron inscritos consecutivamente y se sometieron a inducción de esputo en el Hospital West China. En total, 143 pacientes proporcionaron una muestra de esputo calificada con suficiente ADN para la secuenciación del gen 16S rRNA. Los pacientes fueron seguidos mediante entrevista telefónica cada tres meses durante 1 año para controlar sus exacerbaciones. Posteriormente, como parte de este trabajo, se secuenciaron otros 44 voluntarios sanos reclutados en el mismo centro.

Inducción de esputo y ensayos de muestras.

La inducción del esputo con limpieza bucal estricta para disminuir la contaminación se realizó de acuerdo con protocolos estándar (12). Se tomaron alícuotas de tapón de esputo para el análisis del gen 16S rRNA, la cuantificación del ADN bacteriano, el recuento de células inflamatorias y la detección de citocinas. Después del aislamiento del ADN bacteriano, la región V3-V4 del gen 16S rRNA se amplificó y secuenció en la plataforma Illumina MiSeq PE300 (12) con controles de reactivos adecuados (Métodos complementarios y Fig. 1). Los datos de secuencia sin procesar se han depositado en el Archivo de secuencia del genoma en el Centro Nacional de Datos de Genómica (HRA003966). El ADN bacteriano total se cuantificó utilizando un sistema qPCR ABI7,500 (Applied Biosystems, EE. UU.) con los cebadores de PCR 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3' y 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'. Un panel de 19 mediadores inflamatorios del esputo que incluyen interleucina (IL) – 1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17. , IL-18, IL-23, IL-33, interferón-γ, ligando de quimiocina 1 con motivo CXC, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, S100A8, S100A9 y metaloproteinasa-12 de matriz se analizaron utilizando un kit de ensayo Luminex magnético humano ( Sistemas de I+D, EE.UU.).

Conjuntos de datos públicos del microbioma del esputo

Recuperamos datos públicos de secuenciación del gen 16S rRNA de muestras de esputo de pacientes con EPOC en estabilidad clínica o exacerbación y controles sanos (HC) mediante una búsqueda exhaustiva de literatura en PubMed y una búsqueda de conjuntos de datos en las bases de datos Short Read Archive y European Nucleotide Archive. El término de búsqueda y los criterios de inclusión/exclusión están disponibles en la tabla complementaria. 3. Sólo estudios de casos y controles de EPOC estable versus HC o estudios que comparan la estabilidad de la EPOC versus Se incluyeron las exacerbaciones. Se excluyeron los estudios que reclutaron sujetos con enfermedades respiratorias distintas de la EPOC, que tenían información relevante que indicaba el uso de antibióticos en el último mes antes de la inscripción del sujeto, o que tenían un tamaño de muestra de <20 para el grupo individual (HC o EPOC) después del procesamiento de datos (ilustrado a continuación). .

Preprocesamiento de datos de microbiomas y perfiles taxonómicos.

Todos los conjuntos de datos del gen 16S rRNA se procesaron utilizando una tubería estandarizada en QIIME 2.0 (Quantitative Insights Into Microbial Ecology) (13). Las lecturas de secuenciación demultiplexada se fusionaron, eliminaron el ruido y se resolvieron en variantes de secuencia de amplicones (ASV) utilizando DADA2 (Algoritmo 2 de eliminación de ruido de amplicones divisivos) (14). Se descartaron las muestras con <1000 lecturas limpias. La asignación de taxonomía se realizó con un clasificador Naive Bayes personalizado entrenado en Greengenes Database 13_8 99% de unidades taxonómicas operativas. Se calcularon las métricas de diversidad alfa (índice de Shannon) y diversidad beta (distancia UniFrac ponderada). Se realizó un análisis de coordenadas principales y se utilizó un análisis de varianza multivariado permutacional (999 permutaciones) para las pruebas de significancia. Los taxones con una prevalencia > 5% y una abundancia > 0,05% se mantuvieron para análisis posteriores. Se utilizó el análisis del tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LEfSe) para identificar taxones diferencialmente abundantes (15).

Análisis de redes de coexistencia microbiana.

Para identificar redes de asociación microbiana y al mismo tiempo suprimir correlaciones falsas debido a efectos compositivos de los datos del microbioma, implementamos el análisis de coocurrencia basado en conjuntos ponderados junto con Reboot (dieciséis, 17). Este enfoque calculó cinco medidas de correlación, incluida la información mutua, la disimilitud de Bray-Curtis, la correlación de Spearman y Pearson y los modelos lineales potenciados generalizados (GBLM), y fusionó la ventaja. PAGvalores de las redes de conjunto utilizando la prueba de Simes ponderada. Luego, las puntuaciones de los bordes de la red se fusionaron como un agregado ponderado de las puntuaciones de los bordes absolutos normalizados y el signo asignado según la correlación GBLM, Spearman y Pearson (se describen más detalles en https://github.com/translational-respiratory-lab/The_Interactome). Las redes de co-ocurrencia se visualizaron en Cytoscape 3.9 y los parámetros de la red incluyen el grado de nodo (el número de bordes conectados a un nodo en particular), la centralidad de intermediación (la fracción de caminos más cortos que pasan a través de un nodo) y la centralidad de estrés (el número absoluto de caminos más cortos que pasan a través de un nodo). caminos que pasan a través de un nodo) se calcularon (18).

Agrupación de redes microbianas y predicción de exacerbaciones.

La agrupación espectral se realizó en…

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