Acod1/itaconato activa Nrf2 en las células endoteliales microvasculares pulmonares para proteger contra la endoteliopatía microvascular pulmonar inducida por la obesidad

Resumen

Antecedentes

La obesidad es el principal factor de riesgo que conduce al desarrollo de diversas enfermedades respiratorias, como el asma y la hipertensión pulmonar. Las células endoteliales microvasculares pulmonares (PMVEC) desempeñan un papel importante en el desarrollo de enfermedades pulmonares. La aconitato descarboxilasa 1 (Acod1) media la producción de itaconato, y se ha informado que el eje Acod1/itaconato desempeña un papel protector en múltiples enfermedades. Sin embargo, las funciones del eje Acod1/itaconato en las PMVEC de ratones obesos aún no están claras.

Métodos

Se realizó una secuenciación de ARNm para identificar los genes expresados ​​de manera diferencial (GED) entre las PMVEC inducidas por una dieta alta en grasas (HFD) y las PMVEC alimentadas con pienso en ratones (|log2 fold change| ≥ 1, p ≤ 0,05). Se utilizaron ácidos grasos libres (FFA) para inducir daño celular, inflamación y estrés oxidativo mitocondrial en las PMVEC de ratón después de la transfección con el plásmido sobreexpresado por Acod1 o la administración de 4-octil itaconato (4-OI). Además, investigamos si la vía del factor nuclear eritroide 2-like 2 (Nrf2) estaba involucrada en los efectos de Acod1/itaconato en las PMVEC inducidas por FFA.

Resultados

Se identificó una disminución de la expresión de Acod1 en PMVEC de ratón HFD mediante secuenciación de ARNm. La expresión de Acod1 también se redujo en PMVEC tratadas con FFA. La sobreexpresión de Acod1 inhibió la lesión celular, la inflamación y el estrés oxidativo mitocondrial inducido por FFA en PMVEC de ratón. La administración de 4-OI mostró resultados consistentes en PMVEC de ratón tratadas con FFA. Además, el silenciamiento de Nrf2 revirtió los efectos de la sobreexpresión de Acod1 y la administración de 4-OI en PMVEC tratadas con FFA, lo que indica que la activación de Nrf2 era necesaria para los efectos protectores de Acod1/itaconato.

Conclusión

Nuestros resultados demostraron que el eje Acod1/Itaconato podría proteger a las PMVEC de ratón de las lesiones, la inflamación y el estrés oxidativo mitocondrial inducidos por FFA mediante la activación de la vía Nrf2. Esto fue significativo para el tratamiento de la endoteliopatía microvascular pulmonar causada por la obesidad.

Introducción

La obesidad, un problema de salud mundial, es cada vez más frecuente debido a los estilos de vida sedentarios, la sobrenutrición y el rápido envejecimiento de la población.1). La obesidad es el principal factor de riesgo para el desarrollo de numerosas enfermedades, como la diabetes tipo 2, las enfermedades cardiovasculares, las miocardiopatías y las enfermedades pulmonares, que han amenazado seriamente la salud humana (2,3,4,5). En particular, se ha informado que la obesidad influye en la homeostasis pulmonar a través de la carga de masa, factores hormonales, metabólicos e inflamatorios (5). Las células endoteliales microvasculares pulmonares (PMVEC), que recubren las paredes de los vasos sanguíneos, mantienen la homeostasis interna y las funciones fisiológicas e inmunológicas, además de mediar en el desarrollo de enfermedades pulmonares.6, 7). Múltiples estudios han demostrado que la obesidad conduce a una disfunción endotelial microvascular (8). En este trabajo, se aplicaron PMVEC para explorar el mecanismo molecular por el cual la obesidad afecta la endoteliopatía microvascular pulmonar.

Es ampliamente conocido que el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) ejerce funciones cruciales en la inmunidad y la inflamación (9,10,11). El itaconato, un producto de la descarboxilación del cis-aconitato mediada por la aconitato descarboxilasa 1 (Acod1) en el ciclo del TCA, atrae mucha atención debido a su capacidad para controlar la inflamación e inducir tolerancia inmunitaria (12,13,14). Acod1, también conocido como gen de respuesta inmunitaria 1 (Irg1), se identificó por primera vez como un ADNc de 2,3 kilobases (kb) de macrófagos de ratón inducidos por lipopolisacáridos (LPS) (15). Está surgiendo como un regulador del inmunometabolismo en la inflamación y la infección (dieciséis). Se ha informado ampliamente sobre las funciones antiinflamatorias de Acod1 e Itaconato. Por ejemplo, se ha observado que la deficiencia de Acod1 hace que los ratones pierdan peso rápidamente y aumenta la inflamación en ratones con colitis. Sin embargo, el 4-octil itaconato (4-OI), un derivado del itaconato, retarda los efectos (17). Además, la sobreexpresión de Acod1 y la suplementación con 4-OI pueden proteger contra la inflamación de la microglía y facilitar la recuperación funcional en ratones con lesión de la médula espinal (18). El itaconato mediado por Acod1 limita la fibrosis pulmonar (19), bloquea la infección pulmonar por Brucella (20) y previene la formación de aneurisma aórtico abdominal en ratones (21). Sin embargo, los efectos de Acod1 y el itaconato y los posibles mecanismos moleculares aún no están claros en la endoteliopatía microvascular pulmonar inducida por la obesidad.

El factor nuclear eritroide 2 similar a 2 (Nrf2) es un activador transcripcional antioxidante. Un estudio previo ha demostrado que Acod1/Itaconato reprime la lesión oxidativa y la inflamación durante la isquemia-reperfusión hepática al activar Nrf2 en ratones o hepatocitos (22). Además, el miR-144 hepático se dirige a Acod1, lo que provoca la reducción de itaconato y el consumo del metabolito fumarato del TCA, inhibiendo así la actividad de Nrf2, lo que desencadena una respuesta antioxidante deteriorada en ratones y humanos obesos (23). Por lo tanto, queda claro que la activación de Nrf2 es necesaria durante el tratamiento con Acod1 e itaconato para la endoteliopatía microvascular pulmonar causada por la obesidad.

En este estudio, nuestro objetivo es explorar los efectos y los mecanismos potenciales de Acod1 y 4-OI sobre la lesión, la inflamación y el estrés oxidativo mitocondrial de las PMVEC de ratón inducidos por ácidos grasos libres (FFA).

Materiales y métodos

Ratones

Se alimentó a ratones macho C57BL/6J de seis semanas de edad con una dieta estándar (chow) o una dieta alta en grasas (HFD) durante 29 semanas. Se midió el peso corporal de todos los ratones una vez a la semana. Los ratones fueron sacrificados con anestesia con isoflurano y desangrados de la vena cava inferior. Se recogieron y fotografiaron los tejidos pulmonares, hepáticos y adiposos. Los tejidos pulmonares se utilizaron para el posterior aislamiento de PMVEC de inmediato. El protocolo animal fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Animal del Instituto Provincial de Control de Alimentos y Medicamentos de Henan (n.º 232300421122-1).

Aislamiento e identificación de PMVEC de ratón

Los tejidos pulmonares recolectados se cortaron en trozos pequeños y se molieron para obtener una suspensión celular. Posteriormente, las PMVEC CD45− y CD31+ seleccionadas por las perlas magnéticas CD45 y CD31 (Miltenyi Biotec, Gladbach, Alemania; 10 μL de perlas/107 células) se inocularon en medio Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) (Biosharp, Hefei, China) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) en 5% de CO2 a 37℃. Se utilizó inmunofluorescencia para detectar la expresión de CD31 y cadherina endotelial vascular (VE-cadherina) en las PMVEC. Brevemente, las PMVEC se fijaron en paraformaldehído al 4 % (Sinoreagent, Shanghái, China) y se permeabilizaron en Triton X-100 al 0,1 % (Beyotime Biotech, Shanghái, China). Las PMVEC se incubaron con CD31 anticonejo (1:100; Abclonal, Shanghái, China) y VE-cadherina (Abclonal, Shanghái, China) a 4 ℃ durante la noche. Luego, las células se incubaron con IgG anticonejo de cabra marcada con Cy3 (1:1000; Abcam, Cambridge, Reino Unido) a temperatura ambiente durante una hora. Se utilizó diclorhidrato de 2-(4-amidinofenil) 6-indolcarbamidina (DAPI; Aladdin, Shanghái, China) para la contratinción de los núcleos. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio de fluorescencia (Olympus, Japón).

secuenciación de ARNm

Se extrajo el ARN total de las PMVEC de ratones con dieta alta en grasas y con dieta rica en grasas utilizando el TRIpure (BioTeke, Beijing, China) y posteriormente se utilizó para la secuenciación del ARN. Los datos se analizaron utilizando la plataforma de secuenciación Illumina. Los DEG se determinaron mediante un cambio de log2 ≥ 1 y p ≤ 0,05. Además, se realizaron análisis de las vías Reactome, BioCyc y PANTHER, KEGG y GO para analizar estos DEG.

Contenido de FFA

Los tejidos pulmonares se lavaron con solución salina fisiológica y la humedad de la superficie se absorbió utilizando papel absorbente. A continuación, el homogeneizado de tejido se obtuvo en un baño de hielo utilizando líquido de extracto (10 mL/g) y se centrifugó a 8000 rpm durante 10 min a 4℃ para obtener el sobrenadante. El contenido de proteínas se midió mediante el kit de ensayo de proteínas BCA (Beyotime Biotech, Shanghái, China). Los niveles de FFA en el plasma y los pulmones de los ratones se determinaron utilizando el kit de ensayo de contenido de FFA (Solarbio, Pekín, China).

Tratamiento celular

Para el tratamiento con FFA, las PMVEC se obtuvieron de ratones macho C57BL/6J (de 8 a 10 semanas de edad) mediante selección de CD45− y CD31+ utilizando los métodos anteriores. Estas células se trataron con 500 μM de FFA que contenían 25 % de ácido palmítico sódico (Macklin, Shanghái, China), 25 % de ácido oleico sódico (Macklin, Shanghái, China), 25 % de ácido araquidónico (Yuanye, Shanghái, China) y 25 % de ácido esteárico (Macklin, Shanghái, China) (24) durante 12, 24, 36 y 48 h. A continuación, se recogieron las células para la detección de ARN o proteína Acod1. Los experimentos posteriores se realizaron con tratamiento con FFA durante 36 h.

Para la transfección celular, las PMVEC se cultivaron en 5% de CO2 a 37℃. El plásmido sobreexpresado de Acod1 o el ARNi de Nrf2 (si-Nrf2) se transfectaron en las células utilizando el reactivo LipofectamineTM 3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Se utilizaron plásmidos en blanco o ARNi de control negativo (si-NC) como controles. Para la administración de 4-OI, las células se trataron utilizando 250 μM de 4-OI (Yuanye, Shanghái, China) o un control de vehículo. El tratamiento con FFA se realizó después de la transfección durante 36 h o la administración de 4-OI durante 2 h. La eficiencia de la transfección celular se determinó mediante PCR en tiempo real y transferencia Western después de la transfección durante 36 h.

Viabilidad celular

Las PMVEC (5 × 103/mL) se cultivaron en placas de 96 pocillos en 5% de CO2 a 37℃ (5 × 103/pocillo). A continuación, se añadió CCK-8 (10 μL) y se cultivó durante 2 h. Los datos se registraron a una DO de 450 nm mediante un lector de microplacas (BioTek, EE. UU.). La viabilidad de las PMVEC se evaluó mediante el kit de recuento de células Cell-Counting-Kit-8 (CCK-8; KeyGene Biotech, Nanjing, China).

Actividad de la succinato deshidrogenasa (SDH) y la caspasa 3

Las actividades de SDH de las células se detectaron utilizando el kit de ensayo de actividad de SDH (Solarbio, Beijing, China). Se aplicó el kit de ensayo de actividad de caspasa 3 (Beyotime Biotech, Shanghai, China) para determinar las actividades de la enzima caspasa 3 en las células.

Tinción roja MitoSOX

Los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) mitocondriales se determinaron mediante tinción con MitoSOX Red (Maokang Biotech, Shanghái, China), lo que refleja los niveles de estrés oxidativo en PMVEC. En resumen, las células fueron…

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